Projet de Fin d’Etudes

(INH) constitue le laboratoire national de référence, pour le Ministère de la Santé, et reste l’un des

piliers des enquêtes épidémiologiques menées par le Ministère de la Santé.

Les principales missions du Département de Microbiologie et Hygiène Alimentaire (MHA) sont

d'assurer et de mener à bien toutes les analyses microbiologiques des eaux et des denrées

alimentaires, aussi bien pour les services publiques que pour le secteur privé et de former les

techniciens des laboratoires.

I.2. Missions du Département de Microbiologie et Hygiène Alimentaire

L’une des missions principales du Département de Microbiologie et Hygiène Alimentaire (MHA)

est le renforcement du système d'épidémiosurveillance des toxiinfections alimentaires collectives

(TIAC), par l'introduction de nouvelles techniques spécialisées et d’une méthodologie d'études au

laboratoire qui fournira une information exacte et utile pour lutter contre l'épidémie, tout en

accordant une place importante à la coordination des activités du microbiologiste et de

l'épidémiologiste.

8

Le souci primordial du Département de Microbiologie et Hygiène Alimentaire (MHA) est

l'élargissement de l'éventail des prestations en bactériologie alimentaire, par l'introduction

d’analyses spécialisées à visée diagnostique, afin de prendre en charge les microorganismes des

maladies réémergentes.

Ainsi, par la création d'unités de référence telles que l'unité de référence de Listeria monocytogenes,

l'unité de Clostridium botulinum, l'unité de Campylobacter Coli, l'unité de Legionella, …, le

Département de Microbiologie et Hygiène Alimentaire (MHA) se veut être performant.

I.3. Activités du Département de Microbiologie et Hygiène Alimentaire

Le Département de Microbiologie et Hygiène Alimentaire effectue les analyses microbiologiques

des denrées alimentaires de toutes catégories, des eaux de toutes natures, des échantillons de

l’environnement quel que soit leur origine, des produits cosmétiques, des désinfectants …, selon

des critères, des normes et des réglementations nationaux et internationaux en vigueur.

II. MICROORGANISMES RECHERCHÉS DANS LES ALIMENTS

Trois

types de microorganismes sont conventionnellement recherchés,

lors de

l’analyse

microbiologique des denrées alimentaires. Il s’agit des microorganismes responsables de

l’altération, des microorganismes indicateurs de la contamination fécale et des microorganismes

pathogènes responsables de toxiinfections alimentaires (4).

Parmi les microorganismes responsables de l’altération des aliments, se trouvent la Flore Mésophile

Aérobie Totale (FMAT) et la Flore Fongique constituée par les Levures et Moisissures. Les

microorganismes dits indicateurs de contamination fécale sont les Coliformes Totaux et les

Coliformes Fécaux. Les microorganismes pathogènes

responsables de

toxiinfections

alimentaires sont les Anaérobies SulfitoRéducteurs (ASR), Staphylococcus aureus, Salmonella sp,

Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni et Campylobacter coli, Vibrio cholerae et Vibrio

parahaemolyticus.

II.1. Flore Mésophile Aérobie Totale

La Flore Mésophile Aérobie Totale (FMAT) est un indicateur sanitaire qui permet d’évaluer le

nombre d’Unité Formant Colonie (UFC) présent dans un produit ou sur une surface. L’unité de

dénombrement est l’Unité Formant Colonie, car une colonie observable, sur la surface du milieu

gélosé est le résultat d’un microorganisme vivant isolé à partir d’une spore ou encore d’une

association de microorganismes.

9

Théoriquement, il s’agit alors de rechercher la flore thermophile dont la température optimale de

croissance se situe à +45°C, la flore mésophile dont la température optimale de croissance se situe

entre +20°C et +40°C et la flore psychrophile dont la température optimale de croissance se situe à

+20°C. Leur isolement se faisant sur un milieu gélosé dit ordinaire ou nutritif, la plupart des

microorganismes se développe, sauf les microorganismes exigeants et les microorganismes

anaérobies stricts. Il est donc préférable de parler de Flore Mésophile Aérobie à +30°C, plutôt que

de « Flore Totale » (5).

II.2. Flore Fongique

Les levures sont des organismes unicellulaires qui se divisent par fission et par bourgeonnement.

Étant donné leur grande capacité d’adaptation à de nombreux substrats, les levures sont très

largement répandues dans l’environnement et se retrouvent de façon normale dans le lait. Ce sont

des champignons, chez les lesquels la forme unicellulaire est prédominante. Elles sont classées par

genre et par espèce et sont regroupées au sein de famille, selon leur morphologie et leur mode de

reproduction. Parmi elles, se trouvent, notamment, Geotrichum Candidum et Saccharomyces

cerevisiae.

Les moisissures sont des organismes pluricellulaires qui se propagent par leurs spores. Tout comme

les levures, les moisissures peuvent être véhiculées par l’environnement et se retrouver dans le lait

et dans le fromage. Ce sont des microorganismes filamenteux qui sont disséminés par l’émission

des spore (6) .Les concentrations de moisissures ambiantes ne causent pas d’effets sur la santé de la

majorité des personnes. Cependant, dans des situations où ces concentrations sont anormalement

élevées ou dans le cas de certaines personnes souffrant de problèmes respiratoires ou ayant un

système immunitaire déficient, l’exposition aux moisissures peut favoriser l’apparition de

symptômes de maladies. Les effets ressentis dépendent des espèces présentes, de leurs produits

métaboliques, de la concentration et de la durée de l’exposition ainsi que de la susceptibilité

individuelle.

Les principaux effets sur la santé associés à une exposition aux moisissures sont les réactions

d’hypersensibilité (allergie), les infections et l’irritation. Mais, il s’agit là de transmission par

aérosols et non de d’infection par contamination alimentaire (7).

II.3. Coliformes Totaux et Coliformes Fécaux

Les coliformes fermentent le lactose à +30°C, avec production de gaz. La fermentation du lactose

avec production de gaz est recherchée dans un milieu nutritif spécifique additionné de sels biliaires

et de vert brillant. Parmi les coliformes totaux, les coliformes thermotolérants ou fécaux fermentent

le lactose, à la température de +44°C.

10

Les coliformes sont recherchés dans les aliments, car ce sont de bons marqueurs de l'hygiène de

leurs manipulations. D'origine fécale, ils sont retrouvés dans les eaux usées et le sol. Étant des

bactéries vivant dans les intestins d'animaux ou de l’Homme, leur présence indique alors une

pollution fécale, dans le milieu hydrique. Ainsi, ils sont connus comme étant des organismes

indicateurs de la qualité de l'eau. Cependant, ils ne provoquent pas d'intoxications alimentaires, à

l’exception de Escherichia coli O157:H7 qui est un sérotype particulier responsable de plusieurs

pathologies, dont la colite hémorragique, le syndrome hémolytique et urémique (SHU), et le

purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT). Cette bactérie, potentiellement mortelle, se

trouve généralement à l'intérieur des intestins des bovins. Elle est ainsi responsable de beaucoup

d'intoxications alimentaires causés par de la viande hachée dites « maladie du hamburger ».

Toutefois, on a trouvé récemment cette bactérie dans des plantes vertes, tels des épinards(8).

II.4. Anaérobies SulfitoRéducteurs

Les anaérobies sulfitoréducteurs sont des microorganismes qui se multiplient, en absence d’air, au

cœur des produits, leur résistance à la cuisson étant alors remarquable. Clostridium perfringens est

l’exemple typique de microorganismes anaérobies sulfitoréducteurs.

Elles deviennent pathogènes quand elles pénètrent accidentellement dans l'organisme par voie

cutanée ou intestinale et y produisent leur toxine qui va ensuite altérer les fonctions de défense de

l'organisme. Clostridium perfringens est une bactérie très ubiquitaire largement répandue dans tout

l'environnement (sol, sédiments, cadavres, poussières, surface des végétaux, etc.). Elle est

responsable d'intoxications alimentaires qui surviennent uniquement, après la consommation

d'aliments fortement contaminés par une souche entérotoxinogène. Une partie des bactéries ingérées

est tuée au niveau de l'estomac (pH très acide, milieu riche en protéases, inhibition par la flore

digestive résidente. Mais, l’ingestion d’un nombre important de Clostridium perfringens entraîne sa multiplication, dans le contenu de l'intestin grêle (108-109 UFC.g-1). Ensuite, leur sporulation

synthétise l'entérotoxine qui, libérée après lyse de la paroi bactérienne, interagit avec les entérocytes

provoquant une fuite d'eau et d'électrolytes. De ce fait, Clostridium perfringens est retrouvé en nombre supérieur à106 UFC.g-1, dans les selles des malades (9).

II.4.1. Sources de contamination et Prévention

Dans les aliments, l'intoxication alimentaire est généralement lié avec des arrangements impliquant

de grandes quantités de nourriture, particulièrement de plats de viande et de volaille, généralement

préparés à l'avance et laissés refroidir lentement, ou insuffisamment réfrigérés. Les viandes

produites laminés, les volailles farcies et les tartes offrent des conditions de croissance favorables

au transfert de la contamination. La cuisson des potages, des ragoûts et des sauces créent des

conditions anaérobies idéales, pendant le refroidissement, pour la germination des spores.

11

La maladie est le plus souvent due à l’ingestion de produits carnés, particulièrement les viandes

réchauffées, qui ont été cuits préalablement en masse dans les lieux de restauration rapide.

Les mesures préventives qui peuvent être prises pour éviter la maladie sont :

- d’assurer la manutention des aliments,

- d’avoir une bonne hygiène personnelle et une formation adéquate en sécurité alimentaire,

-

être pleinement conscients des risques encourus dans la cuisine à grande échelle, en

particulier des plats de viande,

- dveiller à ce que des températures adéquates soient atteintes lors de la cuisson,

- d’assurer le refroidissement rapide des aliments cuits en les divisant en petites quantités et

en réalisant leur réfrigération dans des contenants peu profonds (moins de 10 cm de

profondeur),

- de stocker des aliments froids en dessous de +4°C, pour empêcher la multiplication des

bactéries et des toxines produites,

- de réchauffer des aliments, jusqu'à ce que la vapeur chaude en soit dégagée,

-

et, de bien laver les fruits et légumes à l'eau claire et potable avant usage (10).

II.5. Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus est, comme tous les staphylocoques, une bactérie sous forme cocci à Gram

positif, de 1 μm de d'un diamètre environ, apparaissant en amas à l'examen microscopique. Il est

immobile, non sporulé et ne présente pas de capsule visible au microscope optique.

II.5.1. Caractères culturaux

Staphylococcus aureus cultive facilement sur des milieux ordinaires, en aérobiose comme en

anaérobiose, en formant, sur milieux solides, des colonies lisses, luisantes et bombées, plus ou

moins pigmentées en jaune doré d'où l'appellation de staphylocoque "doré". En milieu liquide, il

produit, dans le bouillon, un trouble homogène.

Staphylococcus aureus n'a pas d'exigences particulières. Si les conditions idéales de croissance sont

une température de +37°C et un pH de 7,5, de grandes variations sont tolérées. Comme tous les Micrococacceae, il se multiplie dans des milieux contenant une concentration de 75 g.L-1 de

chlorure de sodium (NaCl).

II.5.2. Potentiel Enzymatique

Outre les enzymes nécessaires aux fonctions métaboliques décrites ci-dessus, Staphylococcus

aureus a la capacité de synthétiser plusieurs enzymes telles que la catalase qui existe chez tous les

Micrococacceae, la coagulase, la désoxyribonucléase, la phosphatase, la hyaluronidase, la

fibrinolysine, la lipase et la protéolysine.

12

La présence d'une coagulase identifie, en pratique courante l'espèce Staphylococcus aureus. La

coagulase libre est une protéine diffusible, réagissant comme la prothrombine et coagulant, en

quelques heures, le plasma citraté de l'Homme ou du lapin. La forme liée, réagit directement avec

le fibrinogène, entraînant l'agglutination de Staphylococcus mis en contact avec du plasma.

L'activité de toutes ces enzymes explique, en partie, la physiopathologie de l'infection

staphylococcique.

Le pouvoir pathogène de Staphylococcus aureus tient également à la production d'un grand nombre

de substances diffusibles. L'hémolysine α ou staphylolysine α est cytotoxique et cytolytique. Elle a

un effet nécrotique sur la peau lié à son effet vasoconstricteur. Quant à la leucocidine, elle agit sur

les granulocytes, les macrophages et les basophiles et provoque leur immobilisation puis leur

dégranulation et leur lyse.

Certaines souches de Staphylococcus aureus élaborent cinq toxines protéiques responsables de

toxiinfections alimentaires dites entérotoxines staphylococciques A, B, C, D, E.

La toxine du syndrome de choc toxique est une toxine pyrogène et létale dite toxine du syndrome de choc toxique ou TSST (20).

II.5.3. Sources de Contamination et Prévention

Les aliments qui sont souvent impliqués dans des intoxications alimentaires à staphylocoques sont

la viande et les produits à base de viande, la volaille, les œufs, des salades, le thon, les pommes de

terre et les macaronis. Sont également impliqués les produits de boulangerie (11).

II.5.4. Pouvoir pathogène chez l’Homme

Staphylococcus aureus est un microorganisme pyogène responsable de la plupart des infections

suppurées de la peau et des muqueuses. Il "surinfecte" souvent les plaies négligées. Les principales

staphylococcies cutanées focales sont dues à la pénétration de Staphylococcus aureus au niveau des

annexes de la peau (follicules pilosébacés, glandes sudoripares) ou dans les muqueuses à l'occasion

d'une plaie, même minime. Elles donnent lieu à des folliculites, furoncles, sycosis, anthrax, orgelets,

hidrosadénites, panaris, onyxis, impétigo et abcès à localisations variées (sein, fesse, marge de

l’anus, aisselle, aine ....). Plus rares sont les conjonctivites, les angines, les phlegmons de

l'amygdale, les otites et les sinusites.

Les manifestations intestinales provoquées par les staphylocoques se présentent sous deux formes :

les toxiinfections alimentaires sont les plus fréquentes : il s'agit de troubles digestifs provoqués par

l'ingestion d'aliments contenant l'entérotoxine préformée, d'incubation très courte (une heure à six

heures après le repas) et évoluant sans fièvre. L’entérocolite aiguë pseudomembraneuse, plus rare,

13

survenant chez des sujets ayant reçu une antibiothérapie qui a sélectionné une souche intestinale de

St. aureus résistante au traitement et sécrétrice d'entérotoxine (12).

II.6. Salmonella

Salmonella, présente dans le tube digestif des animaux et de l’Homme et pouvant être alors à

l’origine de toxiinfections alimentaires très graves, est détruite par la cuisson. Cependant, les

nombreuses espèces de Salmonella diffèrent entre elles, quant à leur pouvoir pathogène. Bien que la

plupart des espèces puissent se retrouver dans les aliments, il est essentiel de prendre en

considération celles qui sont à l’origine de toxiinfections plutôt que celles qui sont à l’origine des

maladies infectieuses graves (fièvres typhoïdes et paratyphoïdes).

II.6.1. Caractères morphologiques

Salmonella est une bactérie en forme de bâtonnet, Gram négatif, anaérobie facultative, non sporulé,

principalement mobile, avec un diamètre de 0,7 μm à 1,5 μm, une longueur de 2 à 5 μm, et des

flagelles péritriches. L’obtention de leur énergie se fait par les réactions d'oxydation et les réactions

de réduction, à partir de sources organiques (13).

II.6.2. Sources de Contamination et Prévention

Les sources de contamination par Salmonella sont le manque d’hygiène lors des manipulations, une

contamination initiale de la matière première (surtout volailles, œufs) et des contaminations croisées

possibles par l’intermédiaire des manipulations et/ou des surfaces de travail. La prévention contre

de telles sources de contamination serait de veiller au nettoyage des mains, du matériel et des

surfaces de travail et de veiller à la qualité des matières premières (14).

Par ailleurs, il est important de bien cuire les aliments, en particulier les viandes et les oeufs. Il faut

aussi bien faire réchauffer les préparations déjà cuites, bien congeler et bien décongeler. Il faut

toujours séparer les aliments non cuites des aliments cuits ou prêts à être consommés.

Il faut toujours éviter les contaminations croisées, en veillant à laver correctement l'endroit où des

préparations ultérieures seront effectuées. Sinon d'autres aliments risquent d'être contaminés quand ils seront déposés à cet endroit (23).

II.7. Listeria monocytogenes

L. monocytogenes, appartenant au genre Listeria et division des Firmicutes, doit son nom à Joseph

Lister. Listeria monocytogenes est la seule espèce du genre Listeria pathogène pour l'Homme.

II.7.1. Caractères morphologiques

Listeria monocytogenes est un bacille de petite taille, non sporulé, anaérobie facultatif, ubiquitaire

(sol, végétaux, eau), à Gram positif, synthétisant une catalase, mobile à +25°C. Elle est mobile,

14

grâce à ses flagelles. Selon certaines études, 1 à 10 % des humains seraient porteurs sains de

Listeria monocytogenes dans leur intestin.

II.7.2. Sources de Contamination et Prévention

Il existe plusieurs sources possibles de transmission de la maladie. Chez l’homme, la transmission

de la mère au fœtus, par la voie hématogène (listériose congénitale), peut se faire par voie digestive

ou par voie respiratoire (infection amniotique, aspiration des microorganismes situés au niveau du

col de l'utérus ou dans le vagin). Les infections nosocomiales sont des sources d’infections

transmissibles, lors d’actes thérapeutiques. Une transmission dite directe, par un simple contact, est

aussi possible. Une transmission indirecte se fait par l’intermédiaire d’un vecteur inanimé comme

les produits d’origine animale (15).

Listeria monocytogenes, étant une bactérie pathogène opportuniste, attaque préférentiellement les

sujets dont le système immunitaire est perturbé. C’est le cas des personnes âgées, des femmes

enceintes, des nouveau-nés et des personnes immunodéprimées telles que les cancéreux, les

transplantés, les personnes dépendantes aux narcotiques et au tabac, les personnes diabétiques mal

équilibrés et les alcooliques. En effet, la listériose est la troisième infection néonatale, après les

infections à Escherichia coli et Streptococcus.

En effet, la bactérie ingérée dans une nourriture quelconque (viande, légume, fromage..) peut

traverser la paroi intestinale et induire divers symptômes tels qu’un état pseudogrippal

apparemment bénin, notamment, chez la femme enceinte. Les symptômes sont plus importants chez

le foetus où la contamination in utero, au moment de l’accouchement, se traduit par des formes

septicémiques généralisées, donnant un avortement ou des complications qui surviennent dès la

naissance et/ou à des formes tardives se traduisant par une méningite. Chez les sujets fragiles,

l’infection peut se

traduire par des atteintes encéphalites neuroméningées. Chez

les

immunocompétents, peut survenir un syndrome pseudo grippal, avec fièvre, souvent inapparent.

La prévention serait la prise de précautions multiples, afin de lutter contre la listériose chez les

femmes enceintes, les patients immunodéprimés et les personnes âgées, d’éviter la consommation

de fromages à pâte molle au lait cru, d’enlever les croûtes de fromages avant leur consommation,

d’éviter la consommation de fromages vendus déjà râpés, d’éviter la consommation de poissons fumés et d’éviter la consommation de graines germées crues (soja, luzerne,…) (16).

II.7.3. Mode d’action

Listeria monocytogenes, capable de résister à la dégradation lysosomiale, par échappement des

phagosomes (vésicule de phagocytose), produit des toxines qui désorganisent la membrane du

phagosome. Une fois dans le cytosol, Listeria monocytogenes peut alors détourner le cytosquelette

d'actine à son profit, pour se déplacer et se propager vers d'autres cellules en répétant les mêmes

actions.

15

Deux des ses protéines de surface (InIA et InIB), en se fixant sur des récepteurs spécifiques

(E-Cadherine et Met) du placenta, permettent à

la bactérie de

traverser

la barrière

hématoencéphalique. La bactérie passe alors d'une cellule à l'autre, en se propulsant dans la cellule

infectée, en crevant la membrane plasmique de l'hôte et de la cible. Elle détourne la machinerie

cellulaire et le cytosquelette d'actine, pour favoriser la polymérisation des monomères d'actine en

une comète qui la propulse. La protéine (Act A), activateur des facteurs de nucléation de l'actine, qui provoque le recrutement et la polymérisation d'actine (16).

II.8. Campylobacter jejuni et campylobacter coli

Campylobacter jejuni et Campylobacter coli, espèces les plus fréquemment isolées chez l’Homme

infecté ou malade, peuvent être transmis de l’animal à l’Homme, par un contact direct avec les

animaux ou par le biais de la consommation ou de la manipulation de produits alimentaires

d’origine animale contaminés.

II.8.1. Caractères culturaux

Campylobacter

jejuni

et Campylobacter Coli

sont des bactéries

thermotolérantes,

à Gram négatif, très mobile, nécessitant pour une croissance optimale des conditions de

microaérophie, à une température de +42°C. L’ajout d’antibiotiques sélectifs, dans les milieux

d’isolement sont plus que nécessaires, à partir d’échantillons de produits alimentaires.

La sous-espèce jejuni et, bien plus fréquemment, isolée que la sous-espèce doylei. Campylobacter

jejuni et Campylobacter Coli sont les 2 espèces pathogéniques d’intérêt majeur car ce sont des

agents zoonotiques (16).

II.8.2. Sources de Contamination et Prévention

La source primaire des infections à Campylobacter jejuni ou Campylobacter coli chez l’Homme

semble être la manipulation ou la consommation des aliments contaminés crus ou mal cuits, la

viande de volaille, les contacts avec les animaux de compagnie et le bétail, la consommation d’eau

contaminée ou de lait cru et les voyages dans les zones à forte prévalence, puisque considérés

comme des facteurs de risque de la maladie humaine (17).

II.8.3. Pouvoir Pathogène

Une infection à Campylobacter jejuni peut engendrer, dans de rares cas, des neuropathies auto

immunes sévères (syndromes de Guillain Barré et de Miller Fisher) provoquées par un mimétisme

moléculaire entre les gangliosides (glycosphingolipides) exprimés dans la cellule nerveuse et les

lipooligosaccharides présents au niveau de la membrane externe de la bactérie.

16

Campylobacter jejuni et Campylobacter coli causent des entérites qui sont beaucoup plus

fréquentes chez l’enfant vivant dans des conditions d’hygiène précaires. Après une incubation de 1

à 3 jours, survient une diarrhée fébrile avec parfois du sang dans les selles ; des douleurs

abdominales et des vomissements sont habituels (18).

II.9. Vibrio parahaemolyticus

Bactérie marine, communément associée à des toxiinfections alimentaires, Vibrio parahaemolyticus

est associé aux produits de la mer.

II.9.1. Caractères culturaux

Vibrio parahaemolyticus est une bactérie qui se présente sous forme de Bacille, à Gram négatif,

oxydase positive, aéroanaérobie facultative, halophile, ayant un optimum de croissance à +37°C,

mais, pouvant croître à des températures de +5°C à +43°C. Elle peut se multiplier, dans les produits

de la mer, entre +10°C et 45°C. Le pH optimal est compris entre 7,8 et 8,6. Vibrio

parahaemolyticus synthétise deux hémolysines, une hémolysine directe thermostable (TDH) et une

hémolysine apparentée à la TDH (TRH).

Dans des conditions défavorables, la bactérie rentre dans un état dit «viable, mais, non cultivable ou

VNC» où elle ne peut être détectée par les techniques classiques de mise en évidence.

II.9.2. Habitat

Vibrio parahaemolyticus est présent dans l'environnement marin (notamment dans les eaux côtières

et les eaux des estuaires) où il est isolé d'eaux dont la température est supérieure à 10°C. Sa

multiplication est favorisée par une température supérieure à 20°C et une salinité modérée de 15 à

25 g par litre).

Le nombre de microorganismes augmente ou chute, en fonction de la température de l'eau. Lorsque

celle-ci est inférieure à +10°C, l'isolement de Vibrio parahaemolyticus est difficile, car il rentre

dans un état viable non cultivable. Les cellules prennent alors un aspect coccoïde et, au microscope

électronique, elles présentent des cloques et elles ont un aspect ridé. La réversion vers les formes

normales est favorisée par une augmentation graduelle de la température. Un autre facteur pouvant

expliquer la diminution du nombre de bactéries dans les eaux froides est liée à la prédation par les

bactéries du genre Bdellovibrio.

En effet, le pouvoir lytique de