METHODES USUELLES D'ANALYSE BACTERIOLOGIQUE POUR LE CONTROLE SANITAIRE COURANT DES EAUX DE MER ET DES COQUILLAGES
METHODES USUELLES D'ANALYSE BACTERIOLOGIQUE POUR LE CONTROLE SANITAIRE COURANT DES EAUX DE MER ET DES COQUILLAGES
SOM MAI R E
l
I I
III
IV
V
VI
VII
Introduction
Nettoyage de la verrerie et sterilisation
Milieux de culture
Techniques d'ensemencement
lIEaux et Coquillages"
A) Préparation de l'echantillon
B) Ensemencement en milieux liquides
C) Ensemencement sur milieux gêlosés
D) Methodes de concentration des germes
Tables N.P.P. de dénombrement des germes
Expression des resultats
Recherche et denombrement des coliformes
A) Coliformes totaux et Coliformes fecaux : methode
utilisant le bouillon lactose à la bile et au vert brillant
B) Colifor~es fécaux : méthode utilisant le milieu
expérimental au Mannitol
VIII
Recherche et dénombrement des Streptocoques fecaux
IX
X
XI
XII
XIII
Recherche des Vibrio parahaemolyticus
Recherche des Salmonella
Recherche des Clostridium sulfito-réducteurs
Technique de coloration des bacteries et methode de Gram
Preparation du reactif pour la recherche de l'indole
References bibliographiques
Pages
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58
Ouistreham, le 10 avril 1981
J. Mazières
1
i
-
l l'ri RODUCï l ON
1 - BASE MICROBIOLOGIQUE DU CONTROLE SANITAIRE
- Le contrôle sanitaire des eaux de mer et des coquillages a pour
but de garantir aux consommateurs des prodluts sans risque pour leur santé. Sont
à redouter les germes pa-chogènes qui se transmettent par voie hydrique tels que
les sallnonelles (fièvres typhoides),
les shigelles (dysenteries), les vibrions
(cholera) et certa:'ns virus CO"jJle ceux l'esponsables des hépatites infectieuses.
La presence dÇorga~ismes pathogènes constituent une preuve convaincante d'une
pollution dangere'.lSe ~ mais lem" nombre est souvent limité dans le milieu et leur
mlse en e,"idence di~~fic2Je à cause de la durée, du coût et parfois de l'insuf
fisance des techniques è_'analyses actuelles. De plus, si on fait de leur présence
le critère de refus de mise à la consommation des denrées éminemment périssables
comme les coquillages. on risque de voir consommer celles-ci avant qu'un
diagnostic soit fait et que des meSUTCS prophylactiques soient prises.
2 - NOTION DE GERt,mS nmrCA'I'EUHS DE CONTAMINATION
Le b~t véritable de l'hygiéniste ne sera donc pas, dans le plupart
des cas, de déceler la presence effective de bactéries pathogènes dans l'eau ou
les coquillages, mais de définir les circonstances dans lesquelles cette presence
est vraisemblable. Les ge~·mes path'Jgènes ci-dessus sont normalement rejetés par
l'hoIlli"lle et les 8.:::J.i:rr:.e,ux à sa'1g chaud par voie intestinale. La mise en évidence
d'une contamination fécale constitue donc un excellent signal d'alarme et permet
d/évaluer les risques encourus par le consommateur éventuel. Une telle conta
mination peut être décelee par la présence d'une bactérie ou d'un groupe de bac
téries particulièrement no!abreuses dans la flore intestinale.
On s'est accordé
à retenir cor:é.:Je organismes témoins les coliformes fécaux pour les raisons suivantes
2
- ils sont toujours présents dans les fecès en concentrations beaucoup plus (109 ~
grandes que les germes pathogenes
co lformes g de matleres fecales
0 10
- 1
1·
.,
/
,
)
- ils ont une résistance aux agents antiseptiques, notamment au chlore et à
ses dérivés, voisine de celle des bactéries pathogènes à l'encontre desquelles
ces produits sont employés ;
- ils produisent des réactions caractéristiques permettant leur mise en évidence
par des techniques simples à la portée de tous les laboratoires.
Sous la dénomination de coli formes sont regroupées plusieurs es
pèces bactériennes appartenant à la famille des entérobactéries et qui, au sein fermentent le lactose avec production de gaz en moins de 48 heures.
de celle-ci,
Cette reacti8n n'étant pas spécifique,
les coliformes constituent un rassemblement
assez hétéroclite du point de vue taxonomique. Bien que tous les coliformes
puissent exister dans les matières fécales, certains sont aussi les hôtes habituels
du sol et des eaux tandis que d'autres ne peuvent vivre que dans le seul habitat
fecal. La presence de ces derniers dans une eau ou dans des coquillages est la
preuve d'une contamination d'origine fécale alors que celle des premiers n'est pas
probante. Escherichia coli est le type de coliforme d'habitat fécal exclusif, mais
on estime que, parmi les germes appartenant aux autres genres, ceux qui vivent
dans l'intestin de l'homme et des anlmaux à sang chaud acquièrent des propriétés
spéciales caractéristiques de cet habitat dont la plus notable est une meilleu~e
résistance aux températures de culture élevées.
Du point de vue pratique, cela se traduit par l'existence de t:.:ois
types d'examens colimétriques :
- la recherche et le dénombrement de l'ensemble des coliformes (coliformes totaux)
sans préjuger de leur appartenance taxonomique et de leur origine. Ce type
d'examen, capital pour la vérification de l'efficacité d'un traitement anti
septiQue, présente peu d'intérêt pour déceler une contamination fécale étant
donné son manque de specificité
- la recherche et le dénombrement des seuls Escherichia coli, examen ayant une
base taxonomique ;
-
la recherche et le dénombrement des coliformes fécaux, examen sans base taxo
no~ique, mais qui met en évidence des germes ayant la même signification pour
3
l'hygiène. La très grande majorité des coliformes fécaux est constituée par
Escherichia coli d'où l'excellente concordance avec la numeration de E. coli
qui
implique une identification systematique.
Pour toutes ces ralsons, le contrôle sanitaire courant des eaux
de mer et des coquillages repose sur la recherche et le dénombrement des coli
formes fécaux qUl sont consideres à l'heure actuelle comme les meilleurs germes
indicateurs d'une contamination fecale.
3 - METHODES D'EXAMEN BACTERIOLOGIQ~~ DE L'EAU ET DES COQUILLAGES
L'analyse bactériologique proprement dite se pratique selon deux
types de méthodes
-
les méthodes de dénombrement direct par comptage de colonies isolées après
ensemencement sur ou dans un support nutritif solide,
-
les méthodes de denombrement indirect, par calcul statistique après répartition
de l'inoculum dans un milieu de culture liquide.
Quel que soit le type de méthodes employé, le résultat de la
numération n'est toujours qu'une approximation du nombre réel de germes présents
dans l'échantillon analysé. De nombreuses causes d'erreur peuvent en effet influer
sur le résultat, par exemple l'homogénéisation, la réalisation des suspensions
mères et des dilutions, la qualification du manipulateur. De plus, la précision
des techniques bactériologiques est faible : elles donnent une valeur qUl se
range à l'intérieur d'un intervalle de confiance plus ou moins large. Pour pallier
cette incertitude et pour tenir compte de la sensibilité variable du consommateur,
les normes bactériologiques imposées sont telles que la limite de sécurite n'est
pas dépassée même si le nombre de germes trouvé est sous-estime par rapport à
la valeur réelle.
3.1.
- Méthodes de dénombrement direct -------------------------------
Ces méthodes ne sont pas applicables aux coquillages. Elles sont
parfois utilisees pour les eaux de mer. L'ensemencement a lieu sur un milieu
gelose selectif, soit directement, soit après filtration d'un certain volume
4
d'eau sur une membrane et dépôt de celle-ci sur le milieu solide. Les bactéries
donnent naissance dans des conditions favorables à des colonies typiques isolées
les unes des autres, différentes suivant les espèces, et qui peuvent être comptees.
Connaissant le volume d'eau ensemencé ou filtré,
le résultat final du dénombrement
peut être exprimé en fonction diun volume pris comme unité : par exemple n colonies
pour 100 ml d'eau.
L'inoculum est réparti dans un certain nombre de tubes contenant
un milieu de culture liquide. La présence de la bactérie ou du groupe de bactéries
recherchées se manifeste par une réaction caractéristique. Un tube est considére
comme étant positif lorsqu'il est le siège de cette réaction caractéristique. On
postule alors qu'il contenait à l'origine au moins un germe recherché. Une éva
luation quantitative n'est possible qu'en jouant sur les volumes de la prise
d'essai et en prenant comme hypothèse que les germes sont repartis de façon
homogène dans l'inoculum : si l'ensemencement porte par exemple sur 10,1 et 0,1 ml
d'inoculum dans trois tubes de milieu liquide, et si le germe recherche est
present seulement dans le premier de ces tubes, il y a aumoins un germe dans 10 ml
d'inoculum, mais il n'yen a pas dans 1 ou 0,1 ml. Si l'unite de volume d'expres
sion du résultat est de 100 ml, il s'ensuit que le nombre de germes est compris
entre 10 et 100 dans 100 ml d'inoculum. Afin d'affiner le dénombrement, plusieurs
tubes par serie sont ensemencés avec le même inoculum. Pour couvrir une gamme
assez etendue de numérations, susceptibles de convenir à la plupart des besoins
en hygiène conchylicole on est parfois amené à faire varier les volumes ensemencés
par tube, le nombre de series et l'échelonnement des dilutions décimales. D'or dinaire on répète l'ensemencement du même inoculum dans 3~4 ou 5 tubes d'une même serie.et on utilise trois séries dans lesquels les inoculums sont respective
ment de 10 ml, 1 ml et 0,1 ml.
Il - NETTOYAGE DE LA VERRERIE ET STERILISATION
5
Les boîtes de gélose ayant servi à l'isolement des germes sont
recouvertes d'une solution de javel durant 30 minutes avant nettoyage.
Ces boîtes~ ainsi que les tubes de bouillon sont vidangés et
lavés à l'eau chaude savonneuse~ ou contenant un agent mouillant biodégradable.
Lorsque des particules grasses demeurent à l'intérieur des récipients on peut
utiliser des détersifs du commerce ou le mélange sulfo-chromique. Dans tous les cas,
le rinçage doit être 3bondant et comporter au moins 5 lavages successifs pour éli
miner toute trace de produits chimiques. Terminer par un rinçage à l'eau distillée ou désionisée afin d'éliminer~ éventuellement, les "louches H dus à l'eau calcaire.
L'utilisation d'un lave-pipette est souhaitable.
Après nettoyage du matêriel ayant contenu des cultures, se laver
soigneusement les mains au savon et les frictionner à l'alcool. Pour les manipu
lations de produits corrosifs (mélange sulfo-chromique notamment), utiliser des
gants de caoutchouc.
Les créneaux des tiges de dispersion du broyeur Ultra-Turrax ainsi
que les lames des bols du broyeur Waring-Blendor doivent être lavés et brossés afin
d'éliminer les particules de chair de coquillages ou de byssus des moules.
Aire de travail
Disposer sur la paillasse une feuille de papier filtre propre, où
seront déposés les coquillages en cours d'analyse.
Après chaque analyse ranger et nettoyer l'aire de travail de la
paillasse à l'aide d'une éponde imbibée d'eau javelisée.
On doit se laver les mains après chaque analyse de coquillages.
Lorsqu'on procède à des examens de cultures pathogènes (Salmonelles,
Vibrions •.. ), prendre grand soin d'éviter toute dissémination intempestive de germes
et nettoyer ensuite la paillasse à l'aide d'une solution javellisée. Se laver
soigneusement les mains et les frictionner à l'alcool à 10° C.
6
Stérilisation
y~!!~!~~- (pipettes, boîtes de pétri en verre,
tubes, éprouvettes).
Elle est protégée par du papier gris et du coton cardé ou des conteneurs appropriés,
et sterilisee au four Pasteur pendant 30 minutes à 180 0 C. Eviter la carbonisation
du papier ou du coton qui doit avoir une teinte licafé au lait" claire à la sortie du
four.
~~!i!~_i~~!!~~~!~_~~!~~~~g~~~- (pinces, scalpels, couteaux à
huîtres). On utilisera de préférence des scalpels entièrement métalliques. Ces ins
truments sont stérilises au moment de l'emploi par trempage dans lialcool à 90° et
flambage. Le passage dans la flawûe ne doit servir qu'à enflammer le fluide
l'ins
trument ne doit pas être maintenu dans la flamme. On peut utiliser l'alcool à brûler
du commerce.
- Bols de l'appareil 1iWaring-Blendorli. Ils sont entourés de papier "gris" ou de papiel
"aluminium" et stérilisés au four Pasteur dans les mêmes conditions que la verrerie.
- Tiges de dispersion de llUltra-Turrax. La stérilisation ne peut se faire au four
Pasteur. Eviter également la stérilisation à la flamme. Procéder de la façon sui
vante :
. placer la tige dans une éprouvette dans le fond de laquelle on aura dispose un
pet~t tampon de coton hydrophile imbibe de 5 ml d'eau environ, ceC1 afin d'assure:
une bonne sterilisation en atmosphère humide
boucher l'éprouvette au coton cardé et stériliser à l'autoclave durant 20 minutes
à 120 0 C.
1
III - MILIEUX DE CULTURE
Il Y a toujours avantage à utiliser les milieux déshydratés du
commerce en raison de la régularité dans leur composition et de leur facilité d'emploi.
Il est p~éférable d'utiliser l'eau désionisée ou l'eau distillee
neutre pour la confection des milieux,
8. défaut l'eau d.éminéralisée peut convenir.
LI ajustement du pH se fait SUT le milieu tièd.e ou froid, de préférence
avant adjonction de colorants si l'on se sert de papier indicateur (du type OXYPHEN).
Mais il est toujours preferable d'utiliser lm pH-mètre electrique. La stérilisation
entraîne souvent une légère baisse du pH (d.e 0,1 il 0,3). Il faut donc ajuster le pH
à une valeur telle qu'après sterilisation il se situe dans les limites voulues.
Sterilisation
Sauf exception, les milieux de culture sont sterilisés à l'autoclave.
Les durées et temperatures de s7:êrilisation sont
indiquées pOUY.' chaque milieu.
Pour les milieux contenant des hydrates de carbone, nous preférons
ne pas depasser la température de 115 0 C, afin d'êvite~ tout risque d'hydrolyse des
sucres. Cette sterilisation est suffisante lorsque les milieux sont répartis en tubes
ne contenant pas plus de 10 à 15 ml de milieu.
Certains milieux ne peuvent être sterilises au-delà de 100 0 C. Ils
sont
indiques dans les méthodes.
8
IV - TECHNIQUES n'ENSEMENCEMENT
EAUX ET COQUILLAGES
A) PREPARATION DE L'ECHfu~TILLON
Comme indiqué precedemment, se laver soigneusement les mains avant
chaque analyse de coquillages.
EAU X
L'ensemencement des eaux en tubes de bouillon n'offre pas de dif
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ficultés particulières: après agitation vigoureuse du flacon une dizaine de fois,
prélever les volumes nécessaires.
L'analyse des coquillages porte sur un nombre d'individus tel que
le volume des corps soit au moins de 40 ml (soit environ, et selon leur taille, 6 à 8 huîtres, une vingtaine de moules, de coques, etc.).
Le broyage au Waring-Blendor permet un broyage fin de la chair et
une bonne libération des germes, mais il ne doit pas excéder trente secondes afin
d'éviter l'échauffement qui pourrait détruire un certain nombre de germes.
Li analyse porte
soit sur la chair seule (CH)
soit de preférence, sur la chair + liquide intervalvaire (CLI)
- CHAIR SEULE -
a -
laver, brosser, égoutter, ouvrir les coquillages après flambage rapide de la
charnière (le byssus des moules doit être coupé au ciseau avant ouverture et
non arrache),
b - rejeter l'eau intervalvaire,
c -
trancher le muscle adducteur et placer les corps dans une éprouvette contenant 10 ml d'eau salee à 1 %et sterile,
9
d - noter le volume des corps par deplacement de lleau,
e - verser dans un bol du Waring-Blendor
(ou dans un becher dans le cas de l'Ultra
Turrax). et ajouter un volume d'eau salee 1 %stérile de sorte que le volume total à broyer (chair de coquillages + eau salee sterile) soit egal à trois
fois le volume de corps mesuré~
f
- broyer durant 30 secondes,
g - prélever aussitôt les volumes nécessaires aux ensemencements.
a -
laver, brosser, égoutter, ouvrir les coquillages après flambage rapide de la
charnière (le byssus des moules doit être coupé au ciseau avant ouverture, et
non arrache),
b - recueillir les eaux intervalvaires dans une première eprouvette,
c -
trancher le muscle adducteur et placer les corps dans une deuxième éprouvette contenant 10 ml d'eau salee 1 %stérile,
d - noter le volume des corps par déplacement de l'eau,
e - verser dans un bol du Waring-Blendor (ou dans un bécher dans le cas de l'Ultra
Turrax), le contenu des deux éprouvettes ci-dessus et y ajouter un volume d'eau salée 1 %stérile de sorte que le volume total à broyer soit égal à trois fois le volume des corps,
f - broyer durant 30 secondes,
g - prélever aussitôt les volumes nécessaires aux ensemencements.
Une réaction positive dans un tube suppose qu'un germe au mOlns ait
été inocule. Un calcul statistique a permis d'établir une correspondance entre le
nombre de tubes positifs dans chaque série et la population probable existant dans
le milieu d'où l'inoculum est issu. Dans la pratique, le passage du nombre de tubes
positifs à la population probable se fait en utilisant les tables de Mac GRADY, (p. 18 à 26).
10
B) ENSEMENCEMENT EN MILIEU LIQUIDE
L'analyse des coquillages pose souvent un problème en raison de
leur teneur élevée en glycogène ou en produits génitaux lorsque le volume
du broyat ensemencé est important~ par exemple 10 ml àans une combinaison
10 - 1 - 0,1 ml
: il risque de se former un bouchon qui place la culture dans
des conditions d'anaérobiose et de toute façon une opacification qui empêche
de voir un dégagement gazeux éventuel. Il convient alors d'ensemencer des
volumes plus faibles ou d'utiliser des tubes de plus fort diamètre.
L'échelonnement numérique correspondant à des séries de 3, 4 ou 5
tubes ensemencés par l'inoculation de trois dilutions décimales est donné C1
dessous en fonction des volumes inoculés.
3 tubes dans
4 tubes dans
5 tubes dans
chaque
série
chaque
série
chaque
série
Eau Coq.
Eau Coq.
3 à 9 à
2 !~OO 7 200
2,3 à 6,9 à
2 160 6 480
2 à 6 à
2 400 7 200
4 800 6 à 18 à 14 400
4,6 à
4 320 : 13,8 à 12 960
4 à 4 800 12 à 14 400
: Combinaison
10 - 1 - 0,1
2
5 - 0,5 - 0,05
"
"
3 :2,5 - 0,25 -0,025: Eau Coq.
9 600 12 à 36 à 28 800
: 9,2 à 8 640 :27,6 à 25 920
8 à
9 600 24 à 28 800
Des dilutions décimales successives permettent d'atteindre des
numérations plus élevées en cas de fortes contaminations présumées : il suffit
alors d'appliquer aux résultats donnés par les tables N.P.P. le coefficient
multiplicateur voulu.
Dans tous les cas, qu'il s'agisse d'eau ou de coquillages, et quelle
que soit la combinaison choisie,
l'ensemencement primaire se fait toujours en
milieu double et chaque tube de 20 x 200 reçoit un volume uniforme de 10 ml,
constitué soit par le produit à analyser lui-même, soit par le mélange "Produit à analyser + eau salée 1 %stérile de dilution".
11
Nous prendrons cornme eX2mple la numération des coli formes fécaux
en ~ilieu d'EIJKMAN. La présence de coliformes est dictée par la production de
gaz résultant de la fermentation du lactose. Pour reconnaître la formation de
gaz on introduit dans le milieu une petite cloche en verre.
En cours diensemencement, on portera attention aux points suivants
- avant chaque inoculation, le milieu à ensemencer doit être agité (aspiré puis
soufflé trois fois avec la pipette dans le fond de l;Gprouvette doucement pour
éviter tout débordement),
- après inoculation dans les tubes 20 x 200, assurer le mélange intime des compo
sants, en remuant les tubes doucement et en prenant soin diéviter toute intro
duction d'air dans la cloche.
Combinaison choisie
Volumes à ensemencer dans chacun des 3, 4 ou
5 tubes de ln SERIE A
Volumes à ensemencer dans chacun des 3, 4 ou 5 tubes de la
VolQ~es à ensemencer dans chacun des 3, 4 ou 5 tubes de la
SERIE B
SERIE C
(dilution au 1/10ème)
(dilution au 1/100ème)
10 - 1 et 0,1 ml
_______~
Répartir directement 10 ml par tube de liquide à analyser
Faire di~ut i on de Il AIl
10 nù
Faire dilution de "B"
10 ml
+ 90 ml eau salee 1%
+ 90 ml eau salée 1%
Mélanger
Mélanger
__=_....;R:..;.é~pl;.a:;;.r=_t..:..J.:;;.·r=__...:..10.::......;ml=··=........Partube : _~~"partir 10 rnl-'2.ar tube
stérile:
stérile:
5 - 0,5 et
0,05 ml
2,5 - 0,25
et
0,025 ml
50 ml liquide à analyser: :+50 ml eau salee 1% stér.:
Faire dilution de "A"
Faire dilution de "BI!
10 ml
10 ml
Mélanger
Répartir 10 ml par tube
+ 90 ml eau salee 1% ste: Mélanger Répartir 10 ml par tube
+ 90 ml eau salée 1% stér.: I>lélanger Répartir 10 ml par tube
25 ml liquide à analyser: :+75 ml eau salee 1% stér.:
Mélanger Répartir 10 ml par tube
Faire dilution de
10 ml
°10 ml
+ 90 ml eau Répartir 10
salee 1% sté: + 90 ml eau salee 1% stêr.: ml par tube
Repartir 10 ml par tube
Tableau récapitulatif des principales combinaisons diensemencement
SCHEMA DES OPERA'fIONS D~gNSEMENCm~EN;l' "EAUX .?ot COQU1LI..i-\GBS"
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de:} t 4 OU 5 tubes plU' l!léI1.e~
• 1,,0) ~2mbptai80n des sé.I:;1;es 1env..: lmlJit.t..2.tLm! SEm 10 ml. ~ Répartir di..,.,ctement
~ 10 ml dana chacun des :3, 4 ou 5 tubes de la aé.rifl
(
Z!J Q2m.binaison g,es séries 2i"JI." - 0,5 IJI.1 ,t O,O~l!'J!
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• • 4
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l!1!81Uall8li&!<&t:.l
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8au. au
; Broyat
SERIE. 5 al
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10 ml dans chacun des ,~ 4 ou 5 tubes de la: .'rie
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. ) + 90 ml eau sal~e ) .
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)
'> ~ et
Hélanger
Répartir
( ~10 roll dans cbactm des :3 f 4 ou 5 tubes de la série
j::J Combinaison des saGes 2,5ml -O.. 25ml et O,025ml
J
1 Hél~r ( ,
et" 1 Répartir (
.
(10 ml dans chacun des 3, 4 011 5 tube. de la aéne
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+ 90 ml eau. salée ----.=?~ ~ et
stérile
1· I-Iélanger
_
Répartir
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. ,
.
.
,:-.',
..
Eau ou Broyat
SERIE 2.5 ml
+ 75 ml eau
salée sté'
l 25 ml l
ml
~!W·9.0f2 &
0 1
ml
' ... 90 ml eau salée
stérUe
~
;..
j
...
r"~""""
I·lélanger 1
. . .'0 ml d*ns cb.acun des '. 4 ou 5. ,tubes de lB: ~'r1~.
.'4'
et Répartir
13
C) ENSEMENCEMENT SUR MILIEUX GELOSES
Ce mode de nuneration n'étant pas applicable aux coquillages, et
délicat dans le cas d'eaux turbides~ l'ISTPM a opté pour la méthode de dénombrement
en milieux liquides, on n'aura pratiquement pas à utiliser les milieux solides
(comptage des colonies caractéristiques sur milieux gélosés sélectifs). Toutefois~
et selon les circonstances (par exemple en cas de dénombrement paucimicrobien
dans les eaux des stations d'épuration de coquillages), il peut être nécessaire
d'utiliser la technique des membranes filtrantes sur milieu de CHAPMAN modifié
(gélose lactosee au chlorure de triphényltétrazolium et au Tergitol), que nous '"
.....
resumons c1-apres :
Peptone ....•..................•...
Extrait de viande •.....•.......••.
Extrait de levure ...........•.•..•
Lactose .......•..................•
Bleu de bromothymol •.•.....•....••
10 g
5 g 6 g
20 g
0,05 G
Eau. 0 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
000
Dissoudre en chauffant modérément et jusqu'à complète dissolution. Refroidir
jusqu'à 50° environ et ajuster le pH à 7,2.
Repartir 100 ml de milieu par flacon de 150 ml. Stériliser à l'autoclave 15 minutes à 115° c.
Au moment de l'emploi, faire fondre au bain-marie bouillant. Après
refroidissement à environ 50° C, ajouter à chaque flacon:
- 5 ml d'une solution stérile de chlorure de 2-3-5 triphényltétrazolium (TTC) à
0,05 %dans l'eau distillée
- 5 ml d'une solution de Tergitol à 0,02 %dans l'eau distillée.
Mélanger intimement sans faire de bulles et couler immédiatement en boîtes de
pétri avant refroidissement, à raison de 25 ml par boîte.
(L'Institut Pasteur fournit le produit déshydraté - base - qu'il suffit de
dissoudre dans la quantité d'eau nécessaire, mais il faut ensuite ~jouter dans
les conditions ci-dessus, au moment de l'emploi,
les deux solutions de TTC et
Tergitol. A noter que des ampoules de ces produits sont également fournies par
Publicité
l'Institut Pasteur).
14
Ensemencement
On utilise des membranes filtrantes de porosité 0,45 ~m, diamètre 5 cm,
livrées stériles.
Liappareil à filtration peut être stérilisé au four Pasteur, après
entourage de papier "igris ou papier d'alu."Jlinium comme la verrerie.
Selon la richesse présumée en germes, on ensemencera de 100 à 500 ml
d'eau sur une, deux ou plusieurs membranes. Après filtration, la membrane est
enlevée à l'aide d'une pince flambée et appliquée soigneusement au centre de la
boîte de pétri, en évitant d'enfermer des bulles d'air.
Si l'on désire obtenir les Coliformes totaux et les Coliformes fécaux
indépendamment, on doit faire deux ensemencements
l'un sera incubé à 37° durant 24 heures (C.T.),
. l'autre sera incubé à 44° en atmosphère saturée d'humidité durant 24 heures (C.F.)
A 37°, toutes les colonies jaunes sont présumées être des coliformes (coli
formes totaux
: ne réduisent pas le triphényltetrazolium).
A 44°, les colonies jaunes sont présumées être des Escherichia coli
(à 95 %)
(coliformes fécaux).
Dans les deux cas, des rep~quages sont nécessaires sur gélose au fer de
KLIGLER\et galerie de diagnostic ou galerie API, si l'on désire une détermination
plus précise des germes.
Dénombrement
On fait la somme des colonies caractéristiques et on rapporte à 100 ml
d'eau selon le volume filtré.
D) METHODES DE CONCENTRATION DES BACTERIES
Lorsque le nombre des bactéries dans un milieu devient trop faible pour
être dénombré dans un volume de liordre de 100 ml (cas des bactéries pathogènes:
Salmonelles, Vibrio parahaemolyticus, etc.), il devient nécessaire de prélever un
volume beaucoup plus important et de procéder à une concentration des microorganis
mes qui y sont éventuellement présents.
Cette opération n'est pas nécessaire dans le cas de coquillages qui,
par suite de leur pouvoir filtrant élevé, assurent une concentration I1 naturelle" des microorganismes. Mais elle peut être indispensable pour les eaux. On utilisera
l'une ou l'autre des methodes suivantes:
15
Très intéressante pour les eaux de consommation , cette méthode est
beaucoup moins aisément applicable pour les eaux de mer qui sont plus ou moins
chargées en matières en suspension vivantes ou inertes et qui ont l'inconvénient
de colmater très vite la membrane.
Néanmoins,
lorsque les eaux sont suffisamment claires, cette méthode
peut être utilisée pour des volumes de 500 ou 1 000 ml, en assurant des filtrations successives à partir de 3, 4 ou 5 membranes différentes.
Dans le cas où lion désire un dénombrement, celui-ci se fait
généralement en utilisant les milieux Geloses choisis, correspondant aux germes
à rechercher, en appliquant les 3. 4 ou 5 membranes ayant assuré la totalité du
volume filtré sur autant de boîtes de gélose.
a) Préparation du lait d'alumine
Dans un ballon Pyrex de 2 litres, mettre 1 litre d'eau + 100 g de
sulfate d'alumine.
Mélanger et precipiter, par additions successives, 190 ml d'am
moniaque à 28 %NH3.
Faire bouillir pendant 5 minutes pour éliminer l'ammoniaque en
... exces.
Laisser décanter 24 heures.
Siphonner ou vider avec précaution le liquide clair surnageant
et le remplacer par le même volume d'eau pure. Agiter vigoureusement et laisser
décanter encore 24 heures.
Refaire cette opération autant de fois que nécessaire jusqu'à
élimination de toute trace d'ammoniaque (s'en assurer à l'aide du réactif de
NESSLER) •
Lorsque l'~oniaque a disparu en totalité, ajouter une dernière
quantité d'eau pure de façon à obtenir un lait assez épais mais suffisamment fluide
pour pouvoir être aisément pipete. Répartir 10 ml par tube de 16 x 160 bouché
vis.
Stériliser 15 minutes à 120 0 C. Très bonne conservation.
16
b) Concentration des germes
Ajouter 10 ml de ce lait d'alumine (1 tube) à 500 ml d'eau à analyser
(ou 2 tubes pour 1 litre).
Agiter vigoureusement pendant 5 minutes.
Laisser décanter au réfrigérateur durant la nuit
Siphonner l'eau surnageante. Le culot d'alumine peut être encore réduit
par centrifugation, mais cette opération n'est pas indispensable.
Un volume de 500 ml d'eau à analyser~ traitée, fournit un culot d'en
viron 10 à 15 ml qui peut être alors ensemence sur les milieux liquides choisis
correspondant aux germes recherchés.
17
v - TABLES N.PoP. DES GERMES EN MILIEU LIQUIDE
Ensemencements en 3 tubes dans les series
10 - 1 - 0,1 ml
5 - 0,5 - 0,05 ml
2,5 - 0,25 - 0,025 ml
Ensemencements en 4 tubes dans les series
10 - 1 - 0,1 ml
5 - 0,5 - 0,05 ml
2,5 - 0,25 - 0,025 ml
PAGES
Eaux
Coquillages
18
19
20
21
23
25
18
19
20
22 24 26
..
Nombre le plus probe:bie d f crgardsmes présents d.ar.s 100 ml dt ea.u, a.J.Irèa ensemencement da
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240 460 11.00 ~2400
Nombre le plus prohable dl orGanismes prés.enta dans 100 ml de c..'1.o.ir da ooqu.iJ.lages, après
enaeœncenent dŒtuoos dans cb.aqu.ne des di11XtiOns : 10 ml - 1 ml- 0,1 ml
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. BOJlI,~ le plus ~X:O~ble d'organismes présenta dans 100 ml d'eau, après ensemencement
d{DtubeS dans chacune des séries : 5 ml - 0,5 ml "" 0,05 ml
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0,5 0,05 ml
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32 40 48 58
1
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30 40 54 68
42 56 70 S4
58 72 88 106
Nombre le plu.s probable cl t orca:nioses présents dtms 100 ml de chiJir de coquillages, après
ensemencement d{D!:ubes darlB chacune des dilutions : 5 r.ù. - 0,5 ml - 0,05 ml
0 0 0 0
1 1 1 1
2 2 2 2
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0 1 2 :3
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258 450 720 960
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NPP
. Nœbre le plus 'ptobable dtorgt'.nismes présents dans 100 ml d.'eou, après ensemencement
d{TItubes dans chacune des séries : 2,5 ml - 0,25 ml - 0,025 ml
Nombre de tubes +
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NPP
Nom.bre de tubes +
2,5 0,25 'O,O~ ml ml . ml
NPP
Nombre da tube:! + - • ml
2,5 0;25 0,025 ml ml
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Nombre le plus prohable dt org-anismes présenta dans 100 ml do clID.ir de coquillages, après
ensemencement de ,
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