METHODES USUELLES D'ANALYSE BACTERIOLOGIQUE POUR LE CONTROLE SANITAIRE COURANT DES EAUX DE MER ET DES COQUILLAGES

hu tres). On utilisera de pr f rence des scalpels enti rement m talliques. Ces ins

truments sont st rilises au moment de l'emploi par trempage dans lialcool 90 et

flambage. Le passage dans la flaw e ne doit servir qu' enflammer le fluide

l'ins

trument ne doit pas tre maintenu dans la flamme. On peut utiliser l'alcool br ler

du commerce.

• Bols de l'appareil 1iWaring-Blendorli. Ils sont entour s de papier "gris" ou de papiel

"aluminium" et st rilis s au four Pasteur dans les m mes conditions que la verrerie.

• Tiges de dispersion de llUltra-Turrax. La st rilisation ne peut se faire au four

Pasteur. Eviter galement la st rilisation la flamme. Proc der de la fa on sui

vante :

. placer la tige dans une prouvette dans le fond de laquelle on aura dispose un

pet~t tampon de coton hydrophile imbibe de 5 ml d'eau environ, ceC1 afin d'assure:

une bonne sterilisation en atmosph re humide

boucher l' prouvette au coton card et st riliser l'autoclave durant 20 minutes

120 0 C.

1

III - MILIEUX DE CULTURE

Il Y a toujours avantage utiliser les milieux d shydrat s du

commerce en raison de la r gularit dans leur composition et de leur facilit d'emploi.

Il est p~ f rable d'utiliser l'eau d sionis e ou l'eau distillee

neutre pour la confection des milieux,

8. d faut l'eau d. min ralis e peut convenir.

LI ajustement du pH se fait SUT le milieu ti d.e ou froid, de pr f rence

avant adjonction de colorants si l'on se sert de papier indicateur (du type OXYPHEN).

Mais il est toujours preferable d'utiliser lm pH-m tre electrique. La st rilisation

entra ne souvent une l g re baisse du pH (d.e 0,1 il 0,3). Il faut donc ajuster le pH

une valeur telle qu'apr s sterilisation il se situe dans les limites voulues.

Sterilisation

Sauf exception, les milieux de culture sont sterilis s l'autoclave.

Les dur es et temperatures de s7: rilisation sont

indiqu es pOUY.' chaque milieu.

Pour les milieux contenant des hydrates de carbone, nous pref rons

ne pas depasser la temp rature de 115 0 C, afin d' vite~ tout risque d'hydrolyse des

sucres. Cette sterilisation est suffisante lorsque les milieux sont r partis en tubes

ne contenant pas plus de 10 15 ml de milieu.

Certains milieux ne peuvent tre sterilises au-del de 100 0 C. Ils

sont

indiques dans les m thodes.

8

IV - TECHNIQUES n'ENSEMENCEMENT

EAUX ET COQUILLAGES

A) PREPARATION DE L'ECHfu~TILLON

Comme indiqu precedemment, se laver soigneusement les mains avant

chaque analyse de coquillages.

EAU X

L'ensemencement des eaux en tubes de bouillon n'offre pas de dif

ficult s particuli res: apr s agitation vigoureuse du flacon une dizaine de fois,

pr lever les volumes n cessaires.

L'analyse des coquillages porte sur un nombre d'individus tel que

le volume des corps soit au moins de 40 ml (soit environ, et selon leur taille,

6 8 hu tres, une vingtaine de moules, de coques, etc.).

Le broyage au Waring-Blendor permet un broyage fin de la chair et

une bonne lib ration des germes, mais il ne doit pas exc der trente secondes afin

d' viter l' chauffement qui pourrait d truire un certain nombre de germes.

Li analyse porte

soit sur la chair seule (CH)

soit de pref rence, sur la chair + liquide intervalvaire (CLI)

• CHAIR SEULE -

a -

laver, brosser, goutter, ouvrir les coquillages apr s flambage rapide de la

charni re (le byssus des moules doit tre coup au ciseau avant ouverture et

non arrache),

b - rejeter l'eau intervalvaire,

c -

trancher le muscle adducteur et placer les corps dans une prouvette contenant

10 ml d'eau salee 1 %et sterile,

9

d - noter le volume des corps par deplacement de lleau,

e - verser dans un bol du Waring-Blendor

(ou dans un becher dans le cas de l'Ultra

Turrax). et ajouter un volume d'eau salee 1 %st rile de sorte que le volume

total broyer (chair de coquillages + eau salee sterile) soit egal trois

fois le volume de corps mesur ~

f

• broyer durant 30 secondes,

g - pr lever aussit t les volumes n cessaires aux ensemencements.

a -

laver, brosser, goutter, ouvrir les coquillages apr s flambage rapide de la

charni re (le byssus des moules doit tre coup au ciseau avant ouverture, et

non arrache),

b - recueillir les eaux intervalvaires dans une premi re eprouvette,

c -

trancher le muscle adducteur et placer les corps dans une deuxi me prouvette

contenant 10 ml d'eau salee 1 %st rile,

d - noter le volume des corps par d placement de l'eau,

e - verser dans un bol du Waring-Blendor (ou dans un b cher dans le cas de l'Ultra

Turrax), le contenu des deux prouvettes ci-dessus et y ajouter un volume d'eau

sal e 1 %st rile de sorte que le volume total broyer soit gal trois fois

le volume des corps,

f - broyer durant 30 secondes,

g - pr lever aussit t les volumes n cessaires aux ensemencements.

Une r action positive dans un tube suppose qu'un germe au mOlns ait

t inocule. Un calcul statistique a permis d' tablir une correspondance entre le

nombre de tubes positifs dans chaque s rie et la population probable existant dans

le milieu d'o l'inoculum est issu. Dans la pratique, le passage du nombre de tubes

positifs la population probable se fait en utilisant les tables de Mac GRADY,

(p. 18 26).

10

B) ENSEMENCEMENT EN MILIEU LIQUIDE

L'analyse des coquillages pose souvent un probl me en raison de

leur teneur lev e en glycog ne ou en produits g nitaux lorsque le volume

du broyat ensemenc est important~ par exemple 10 ml ans une combinaison

10 - 1 - 0,1 ml

: il risque de se former un bouchon qui place la culture dans

des conditions d'ana robiose et de toute fa on une opacification qui emp che

de voir un d gagement gazeux ventuel. Il convient alors d'ensemencer des

volumes plus faibles ou d'utiliser des tubes de plus fort diam tre.

L' chelonnement num rique correspondant des s ries de 3, 4 ou 5

tubes ensemenc s par l'inoculation de trois dilutions d cimales est donn C1

dessous en fonction des volumes inocul s.

3 tubes

dans

4 tubes

dans

5 tubes

dans

chaque

s rie

chaque

s rie

chaque

s rie

Eau

Coq.

Eau

Coq.

3

9

2 !~OO

7 200

2,3

6,9

2 160

6 480

2

6

2 400

7 200

4 800

6

18 14 400

4,6

4 320

: 13,8 12 960

4 4 800

12 14 400

: Combinaison

10 - 1 - 0,1

2

5 - 0,5 - 0,05

"

"

3 :2,5 - 0,25 -0,025: Eau

Coq.

9 600

12

36 28 800

: 9,2

8 640

:27,6 25 920

8

9 600

24 28 800

Des dilutions d cimales successives permettent d'atteindre des

num rations plus lev es en cas de fortes contaminations pr sum es : il suffit

alors d'appliquer aux r sultats donn s par les tables N.P.P. le coefficient

multiplicateur voulu.

Dans tous les cas, qu'il s'agisse d'eau ou de coquillages, et quelle

que soit la combinaison choisie,

l'ensemencement primaire se fait toujours en

milieu double et chaque tube de 20 x 200 re oit un volume uniforme de 10 ml,

constitu soit par le produit analyser lui-m me, soit par le m lange "Produit

analyser + eau sal e 1 %st rile de dilution".

11

Nous prendrons cornme eX2mple la num ration des coli formes f caux

en ~ilieu d'EIJKMAN. La pr sence de coliformes est dict e par la production de

gaz r sultant de la fermentation du lactose. Pour reconna tre la formation de

gaz on introduit dans le milieu une petite cloche en verre.

En cours diensemencement, on portera attention aux points suivants

• avant chaque inoculation, le milieu ensemencer doit tre agit (aspir puis

souffl trois fois avec la pipette dans le fond de l;Gprouvette doucement pour

viter tout d bordement),

• apr s inoculation dans les tubes 20 x 200, assurer le m lange intime des compo

sants, en remuant les tubes doucement et en prenant soin di viter toute intro

duction d'air dans la cloche.

Combinaison

choisie

Volumes ensemencer

dans chacun des 3, 4 ou

5 tubes de ln

SERIE A

Volumes ensemencer

dans chacun des 3, 4 ou

5 tubes de la

VolQ~es ensemencer

dans chacun des 3, 4 ou

5 tubes de la

SERIE B

SERIE C

(dilution au 1/10 me)

(dilution au 1/100 me)

10 - 1 et

0,1 ml

_______~

R partir directement

10 ml par tube de

liquide analyser

Faire di~ut i on de Il AIl

10 n

Faire dilution de "B"

10 ml

+ 90 ml eau salee 1%

+ 90 ml eau sal e 1%

M langer

M langer

__=_....;R:..;. ~pl;.a:;;.r=_t..:..J.:;;. r=__...:..10.::......;ml= =........Partube : _~~"partir 10 rnl-'2.ar tube

st rile:

st rile:

5 - 0,5 et

0,05 ml

2,5 - 0,25

et

0,025 ml

50 ml liquide analyser:

:+50 ml eau salee 1% st r.:

Faire dilution de "A"

Faire dilution de "BI!

10 ml

10 ml

M langer

R partir 10 ml par tube

+ 90 ml eau salee 1% ste:

M langer

R partir 10 ml par tube

+ 90 ml eau sal e 1% st r.:

I>l langer

R partir 10 ml par tube

25 ml liquide analyser:

:+75 ml eau salee 1% st r.:

M langer

R partir 10 ml par tube

Faire dilution de

10 ml

10 ml

+ 90 ml eau

R partir 10

salee 1% st : + 90 ml eau salee 1% st r.:

ml par tube

Repartir 10 ml par tube

Tableau r capitulatif des principales combinaisons diensemencement

SCHEMA DES OPERA'fIONS D~gNSEMENCm~EN;l' "EAUX .?ot COQU1LI..i-\GBS"

.t::~

,j Sb;kIES

_

lfWlP

___- - - - - -.. - . - - . -......._ ......_..__........._......_._.. "!"!'t!l~_"'''''jjw_.....

iZI

.-------.----------

. "

de:} t 4 OU 5 tubes plU' l!l I1.e~

" 1,,0) ~2mbptai80n des s .I:;1;es 1env..: lmlJit.t..2.tLm!

SEm 10 ml.

~ R partir di..,.,ctement

~ 10 ml dana chacun des :3, 4 ou 5 tubes de la a .rifl

(

Z!J Q2m.binaison g,es s ries 2i"JI." - 0,5 IJI.1 ,t O,O~l!'J!

:h

" " 4

__,

b

..

l!1!81Uall8li&!<&t:.l

v 111

p

1

8au. au

; Broyat

SERIE. 5 al

) 50 ml

.

) + 50 ml e au '

st ~_le

sal e

1~1 langer!

et

R partir

10 ml dans chacun des ,~ 4 ou 5 tubes de la: .'rie

" .

10 ml

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-+ 90 ml eau sal e )

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.~tU:E 0,05 ;! '.

i

to ml.

. )

+ 90 ml eau sal~e ) .

s"rile .

)

'> ~ et

H langer

R partir

(

~10 roll dans cbactm des :3 f 4 ou 5 tubes de la s rie

j::J Combinaison des saGes 2,5ml -O.. 25ml et O,025ml

J

1 H l~r ( ,

et"

1 R partir (

.

(10 ml dans chacun des 3, 4 011 5 tube. de la a ne

to ml

+ 90 ml eau. sal e ----.=?~ ~ et

st rile

1 I-I langer

_

R partir

llO ml dBna chamm de. 3, 4 ou 5 tubes ~ 1&~

. ,

.

.

,:-.',

..

Eau ou

Broyat

SERIE 2.5 ml

+ 75 ml eau

sal e st '

l 25 ml

l

ml

~!W 9.0f2 &

0

1

ml

'

... 90 ml eau sal e

st rUe

~

;..

j

...

r"~""""

I l langer 1

. .

.'0 ml d*ns cb.acun des '. 4 ou 5. ,tubes de lB: ~'r1~.

.'4'

et

R partir

13

C) ENSEMENCEMENT SUR MILIEUX GELOSES

Ce mode de nuneration n' tant pas applicable aux coquillages, et

d licat dans le cas d'eaux turbides~ l'ISTPM a opt pour la m thode de d nombrement

en milieux liquides, on n'aura pratiquement pas utiliser les milieux solides

(comptage des colonies caract ristiques sur milieux g los s s lectifs). Toutefois~

et selon les circonstances (par exemple en cas de d nombrement paucimicrobien

dans les eaux des stations d' puration de coquillages), il peut tre n cessaire

d'utiliser la technique des membranes filtrantes sur milieu de CHAPMAN modifi

(g lose lactosee au chlorure de triph nylt trazolium et au Tergitol), que nous

'"

.....

resumons c1-apres :

Peptone ....".................."...

Extrait de viande "....."......."".

Extrait de levure ...........".".."

Lactose .......".................."

Bleu de bromothymol "."....."....""

10 g

5 g

6 g

20 g

0,05 G

Eau. 0 " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "

000

Dissoudre en chauffant mod r ment et jusqu' compl te dissolution. Refroidir

jusqu' 50 environ et ajuster le pH 7,2.

Repartir 100 ml de milieu par flacon de 150 ml.

St riliser l'autoclave 15 minutes 115 c.

Au moment de l'emploi, faire fondre au bain-marie bouillant. Apr s

refroidissement environ 50 C, ajouter chaque flacon:

• 5 ml d'une solution st rile de chlorure de 2-3-5 triph nylt trazolium (TTC)

0,05 %dans l'eau distill e

• 5 ml d'une solution de Tergitol 0,02 %dans l'eau distill e.

M langer intimement sans faire de bulles et couler imm diatement en bo tes de

p tri avant refroidissement, raison de 25 ml par bo te.

(L'Institut Pasteur fournit le produit d shydrat - base - qu'il suffit de

dissoudre dans la quantit d'eau n cessaire, mais il faut ensuite ~jouter dans

les conditions ci-dessus, au moment de l'emploi,

les deux solutions de TTC et

Tergitol. A noter que des ampoules de ces produits sont galement fournies par

l'Institut Pasteur).

14

Ensemencement

On utilise des membranes filtrantes de porosit 0,45 ~m, diam tre 5 cm,

livr es st riles.

Liappareil filtration peut tre st rilis au four Pasteur, apr s

entourage de papier "igris ou papier d'alu."Jlinium comme la verrerie.

Selon la richesse pr sum e en germes, on ensemencera de 100 500 ml

d'eau sur une, deux ou plusieurs membranes. Apr s filtration, la membrane est

enlev e l'aide d'une pince flamb e et appliqu e soigneusement au centre de la

bo te de p tri, en vitant d'enfermer des bulles d'air.

Si l'on d sire obtenir les Coliformes totaux et les Coliformes f caux

ind pendamment, on doit faire deux ensemencements

l'un sera incub 37 durant 24 heures (C.T.),

. l'autre sera incub 44 en atmosph re satur e d'humidit durant 24 heures (C.F.)

A 37 , toutes les colonies jaunes sont pr sum es tre des coliformes (coli

formes totaux

: ne r duisent pas le triph nyltetrazolium).

A 44 , les colonies jaunes sont pr sum es tre des Escherichia coli

( 95 %)

(coliformes f caux).

Dans les deux cas, des rep~quages sont n cessaires sur g lose au fer de

KLIGLER\et galerie de diagnostic ou galerie API, si l'on d sire une d termination

plus pr cise des germes.

D nombrement

On fait la somme des colonies caract ristiques et on rapporte 100 ml

d'eau selon le volume filtr .

D) METHODES DE CONCENTRATION DES BACTERIES

Lorsque le nombre des bact ries dans un milieu devient trop faible pour

tre d nombr dans un volume de liordre de 100 ml (cas des bact ries pathog nes:

Salmonelles, Vibrio parahaemolyticus, etc.), il devient n cessaire de pr lever un

volume beaucoup plus important et de proc der une concentration des microorganis

mes qui y sont ventuellement pr sents.

Cette op ration n'est pas n cessaire dans le cas de coquillages qui,

par suite de leur pouvoir filtrant lev , assurent une concentration I1 naturelle"

des microorganismes. Mais elle peut tre indispensable pour les eaux. On utilisera

l'une ou l'autre des methodes suivantes:

15

Tr s int ressante pour les eaux de consommation , cette m thode est

beaucoup moins ais ment applicable pour les eaux de mer qui sont plus ou moins

charg es en mati res en suspension vivantes ou inertes et qui ont l'inconv nient

de colmater tr s vite la membrane.

N anmoins,

lorsque les eaux sont suffisamment claires, cette m thode

peut tre utilis e pour des volumes de 500 ou 1 000 ml, en assurant des filtrations

successives partir de 3, 4 ou 5 membranes diff rentes.

Dans le cas o lion d sire un d nombrement, celui-ci se fait

g n ralement en utilisant les milieux Geloses choisis, correspondant aux germes

rechercher, en appliquant les 3. 4 ou 5 membranes ayant assur la totalit du

volume filtr sur autant de bo tes de g lose.

a) Pr paration du lait d'alumine

Dans un ballon Pyrex de 2 litres, mettre 1 litre d'eau + 100 g de

sulfate d'alumine.

M langer et precipiter, par additions successives, 190 ml d'am

moniaque 28 %NH3.

Faire bouillir pendant 5 minutes pour liminer l'ammoniaque en

...

exces.

Laisser d canter 24 heures.

Siphonner ou vider avec pr caution le liquide clair surnageant

et le remplacer par le m me volume d'eau pure. Agiter vigoureusement et laisser

d canter encore 24 heures.

Refaire cette op ration autant de fois que n cessaire jusqu'

limination de toute trace d'ammoniaque (s'en assurer l'aide du r actif de

NESSLER) "

Lorsque l'~oniaque a disparu en totalit , ajouter une derni re

quantit d'eau pure de fa on obtenir un lait assez pais mais suffisamment fluide

pour pouvoir tre ais ment pipete. R partir 10 ml par tube de 16 x 160 bouch

vis.

St riliser 15 minutes 120 0 C. Tr s bonne conservation.

16

b) Concentration des germes

Ajouter 10 ml de ce lait d'alumine (1 tube) 500 ml d'eau analyser

(ou 2 tubes pour 1 litre).

Agiter vigoureusement pendant 5 minutes.

Laisser d canter au r frig rateur durant la nuit

Siphonner l'eau surnageante. Le culot d'alumine peut tre encore r duit

par centrifugation, mais cette op ration n'est pas indispensable.

Un volume de 500 ml d'eau analyser~ trait e, fournit un culot d'en

viron 10 15 ml qui peut tre alors ensemence sur les milieux liquides choisis

correspondant aux germes recherch s.

17

v - TABLES N.PoP. DES GERMES EN MILIEU LIQUIDE

Ensemencements en 3 tubes dans les series

10 - 1 - 0,1 ml

5 - 0,5 - 0,05 ml

2,5 - 0,25 - 0,025 ml

Ensemencements en 4 tubes dans les series

10 - 1 - 0,1 ml

5 - 0,5 - 0,05 ml

2,5 - 0,25 - 0,025 ml

PAGES

Eaux

Coquillages

18

19

20

21

23

25

18

19

20

22

24

26

..

Nombre le plus probe:bie d f crgardsmes pr sents d.ar.s 100 ml dt ea.u, a.J.Ir a ensemencement da

WtubeS d..a.r'..s ch1:t.c'Jne des, dilU:tiO:n.."l

:

0 ml - 1 ml.- 0t1 ml

No~br. 4.

tubes ...

H)

ml

1

ml

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1

ml

10

ml

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' ml

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tube;] -+

Nombre de

tubes -+

1

10

III ml

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19

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20

21

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14

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290

240

460

11.00

~2400

Nombre le plus prohable dl orGanismes pr s.enta dans 100 ml de c..'1.o.ir da ooqu.iJ.lages, apr s

enaeSncenent dRtuoos dans cb.aqu.ne des di11XtiOns : 10 ml - 1 ml- 0,1 ml

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