Cours de biologie cellulaire

cellulaires dun

organisme si elle

est

totipotente:

(zygote et tr s jeunes cellules embryonnaires)

En plusieurs types de cellules : cellules pluripotentes ou cellules souches

Peut sauto-renouveler

Sp cialis e : cellules souches h matopo tiques, de l piderme &

10

4. Cas des virus

Les virus sont des structures vivantes constitu es par un

mat riel g n tique (ADN ou ARN) et par une coque

prot ique.

Les virus se caract risent par:

Absence des structures cellulaires essentielles comme la

membrane plasmique, lhyaloplasme ou les ribosomes.

La n cessit de la machinerie cellulaire dune cellule

h te pour se reproduire. Hors des cellules h tes cest un

simple assemblage de macromol cules.

DONC ce ne sont pas des cellules: cest un tat dit acaryote

11

Chapitre 2

Composition chimique de la cellule

Les tres vivants sont compos s de trois types de mati res quon peut d couvrir successivement

lorsquun chantillon vivant est expos la chaleur:

De la vapeur deau se d gage en premier r v lant la pr sence de leau. Sa teneur d passe en g n ral

les 60 %.

L chantillon devient noir cause de la combustion dune mati re riche en carbone: la mati re

organique.

A la fin de la combustion, il persiste de cendres compos es d l ments min raux.

1. Eau

1.1. Structure de leau

Cest une petite mol cule (PM = 18). Elle

pr sente un atome doxyg ne li par liaisons

covalentes deux atomes dhydrog ne.

Loxyg ne attire le nuage lectronique et

constitue une charge partielle n gative alors

que les hydrog nes pr sentent une charge

12

partielle positive: leau est une mol cule polaire.

Leau, par sa nature polaire, attire les autres mol cules polaires et les ions (hydrophiles) et repousse les

mol cules apolaires (hydrophobes)

Leau peut aussi se dissocier en H+ et OH-.L quilibre est mesur par le pH.

1.2. Leau dans la cellule

Leau est la mol cule la plus abondante dans les

cellules vivantes. Elle d passe les 60 % de la mati re

vivante. Ses r les les plus importants sont :

Cest le solvant de beaucoup de substances

cellulaires.

Cest le milieu o se d roule la quasi-totalit des

r actions biologiques.

Il peut participer comme substrat (r actif) ou se

lib rer comme produit dans certaines r actions

comme lhydrolyse.

Il contribue, par son interaction avec les mol cules hydrophiles et/ou hydrophobes, stabiliser

beaucoup de structures cellulaires comme les membranes.

2. Les substances organiques

Ce sont des mol cules dont latome principal est le carbone. La mol cule la plus simple est le m thane

qui comprend un atome de carbone associ 4 atome dhydrog ne.

Il existe quatre types de mol cules organiques:

Les glucides

Les lipides

Les prot ines

Les acides nucl iques

13

2.1. Les glucides

Les glucides comprennent les sucres et leurs polym res. Les

glucides comprennent le carbone, loxyg ne et lhydrog ne. Le

nom des glucides se termine par ose.

On distingue :

Les monosaccharides: ce sont les glucides les plus simples

avec une formule chimique constitu e dun multiple de

CH2O. Le plus connu est le glucose.

Les disaccharides: cest lassociation de deux

monosaccharides. Le plus connu est le

saccharose.

Les polysaccharides: Cest lassociation dun

grand nombre de monosaccharides pour

former des polym res.

Exemple 1: lamidon qui constitue la forme de

r serve dans les graines (haricot) ou les

tubercules.

Exemple 2: la cellulose qui est le principal

constituant de la paroi v g tale

14

Les principaux r les des glucides sont :

Source d nergie pour la cellule

Entrent dans la composition des acides nucl iques

Composent la paroi des cellules v g tales et bact riennes

Font partie de la membrane plasmique o ils jouent, entre autres, le r le dans ladh rence et la

reconnaissance cellulaires

2.2. Les lipides

Ce sont des mol cules hydrophobes ou amphiphiles(mol cules hydrophobes poss dant un

domaine hydrophile) tr s diversifi es. Ils Comprennent entre autres les graisses, les cires, les st rols

les vitamines liposolubles, les mono-, di- et triglyc rides, ou encore les phospholipides.

Dans le cadre de ce cours nous

nous limiterons l tude des

acides gras et leurs

associations en triglyc rides et

en phospholipides

Les acides gras sont de

longues cha nes carbon es nombre pair de carbones et portant une fonction acide au niveau du carbone

1.

15

Ces acides gras peuvent tre:

Satur s sils ne comprennent que des simples liaisons.

Insatur s sils portent au moins une double ou triple liaison.

Les acides gras peuvent r agir avec une

mol cule de glyc rol peuvent former

soit un triglyc ride.

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Lassociation du glyc rol avec deux acides gras et un groupement phosphate associ un groupement

hydrophile donne un lipide amphiphile: cest un phospholipide.

Les r les des lipides sont multiples. On peut citer entre autres :

Constitution de la bicouche lipidique des membranes.

Source importante d nergie pour la cellule

Forme de r serves chez les v g taux (graines ol agineuses) et chez les animaux (tissus adipeux)

Constitution des hormones lipophiles.

2.3. Les prot ines

Les prot ines sont des cha nes dacides amin s

reli s entre eux par des liaisons peptidiques

CO-NH.

Un acide amin est une mol cule carbon e

comprenant un groupe carboxyle (-COOH), un

groupe amine (-NH2) et une cha ne lat rale

variable (-R) qui diff re entre les 20 acides amin s.

17

Les acides

amin s peuvent

avoir

diff rentes

propri t s

selon la nature

de leur cha ne

lat rale.

La synth se des

prot ines passe

par la formation dune liaison covalente dite liaison peptidique entre les acides amin s pour former une

cha ne lin aire dacides amin s. La succession des acides amin s varie dune prot ine l autre. On

parle de s quence primaire. Diff rentes interactions au sein des cha nes peptidiques donnent une

structure secondaire, tertiaire puis quaternaire aboutissant une structure tridimensionnelle particuli re

permettant la fonctionnalit de la prot ine.

Les r les des prot ines sont tr s nombreux. On peut les classer en 2 cat gories :

18

Prot ines de structure: beaucoup de prot ines participent diff rentes structures cellulaires

comme les membranes, le cytosquelette et dautres.

Prot ines enzymatiques : les r actions de la cellule vivante sont catalys es par des prot ines

appel es enzymes.

2.4. Les acides nucl iques

Voir plus loin

3. Sels min raux

Les sels min raux sont les constituants qui restent (sous forme de cendres) apr s calcination des tissus

organiques.

Chimiquement, ce sont des l ments ionis s charg s soit positivement (cations) ou n gativement

(anions).

Les sels min raux sont essentiels l'organisme, notamment parce qu'ils :

• contr lent l' quilibre hydrique (pression osmotique)

• r glent l' quilibre acide-base (pH)

• font partie de certaines structures (os, dents)

• entrent dans la composition des enzymes, des hormones

• catalysent de nombreuses r actions du m tabolisme

Selon les quantit s mises en jeu dans l'organisme, les sels min raux sont couramment

divis s en 2 groupes:

• les l ments principaux ou macro l ments: Ca, P, K, Cl, Na, Mg

• les l ments traces ou oligo l ments: Fe, Zn, Cu, Mn, I, Mo, etc.

19

Chapitre 3

M thodes d tude de la cellule

1. La microscopie

Le microscope transmission (photonique ou

lectronique) permet dobserver. sur une coupe

tr s fine les d tails infiniment petits dun objet

(animal, plante, roche).

1.1. Le microscope optique

La figure ci-contre montre un microscope optique

et ses diff rentes composantes. Il permet de

visualiser des objets tr s fins, mont s dans une

goutte deau ou de liquide color sur une lame

porte objet et recouvert dune lamelle couvre objet

tr s fragile, ou des coupesfix es et color es selon

un protocole qui sera pr sent ult rieurement. La

lumi re qui traverse lobjet remonte dans les

lentilles de verre (objectif et oculaire) ce qui

agrandit lobjet.

Lobservation au microscope passe par les tapes

suivantes :

Pr paration de

lobservation:

la

pr paration observer est plac e sur la

platine et centr e pour que la lumi re

traverse le tube optique donnant un

rond lumineux dans loculaire.

La mise au point: le petit objectif

(faible grossissement) est plac dans

laxe du tube optique. Il faut ensuite

regarder dans loculaire et, laide de

20

la vis macrom trique de mise au point, remonter le tube jusqu lobtention dune image

nette.

Exploration de la pr paration : la pr paration est d plac e d licatement jusqu trouver

lobjet recherch .

Changement de grossissement: il faut placer la zone agrandir au centre de la platine, puis

changer dobjectif en tournant le barillet, sans toucher au r glage pr c dent. Le changement

dobjectif se fait toujours du plus faible au plus fort grossissement. La nouvelle mise au point

se fait seulement par la petite vis.

Que faire pour ne pas endommager les pr parations ?

Toujours commencer lobservation avec lobjectif le plus faible.

Nutiliser la vis macrom trique (la grosse) qu faible grossissement.

Fixer la lame avec les valets : si lun deux est manquant, ne pas incliner le microscope!

Ne jamais descendre le tube sans surveiller la platine et la lame en regardant sur le c t .

Aux grossissements sup rieurs, nutiliser que la vis microm trique.

Si la vis semble bloqu e, il faut sassurer

que lobjectif nappuie pas sur la lame.

1.2. Microscope lectronique transmission

1.2.1. Principe du fonctionnement

Il est comparable celui du microscope photonique.

La source S est une cathode qui met des lectrons (au

lieu des photons) qui sont acc l r s par

lapplication dune diff rence de potentiel entre la

cathode et lanode (60 100 Kv). Le vide pouss

lint rieur du ME est n cessaire au d placement des

lectrons. Les lectrons traversent 3 lentilles

lectromagn tiques L1, L2, L3 et lobjet AB.

• L1 : le condensateur permet de focaliser le

flux d lectrons sur lobjet.

• L2 et L3 jouent le r le dobjectif et permettent

lagrandissement de lobjet AB.

21

Limage est observ e directement sur l cran rendu fluorescent par le bombardement lectronique ou sur

une plaque photographique. Le MET permet des grossissements allant de 2000 un million.

1.2.2. Pr paration des coupes cellulaires ultrafines

Les cellules doivent tre coup es en tranches tr s fines (50 100 nm) pour permettre aux lectrons de les

traverser, pour cela :

• Les cellules sont tu es par des fixateurs

(glutarald hyde, t troxyde dosmium) qui

pr servent les structures cellulaires.

• Les chantillons fix s sont lav s dans

leau, puis d shydrat s par des solvants

organiques (ac tone).

• Les chantillons sont inclus dans une r sine

(araldite).

• Les blocs de r sine renfermant l chantillon

sont coup s laide dun ultra microtome

muni dun couteau de verre ou de diamant.

• Les coupes cellulaires sont recueillies sur

une grille en cuivre. La grille est tremp e

dans une solution de m taux lourds

(uranium, plomb) pour noircir les structures

cellulaires et augmenter le contraste. La

grille est ensuite introduite dans le MET pour lobservation.

22

1.3. .Comparaison entre microscope lectronique transmission et microscope photonique

La figure ci-contre montre que les deux fonctionnent selon les m mes principes. Les diff rences r sident

dans la nature de la source (lampe ou cathode), la nature des lentilles (en verre ou lectromagn tiques) et

en fin le mode dobservation : lSil pour le microscope photonique et l cran ou le clich pour le

microscope lectronique.

Source d nergie

Couleur

Etat des cellules

Grossissement

Microscope lectronique

Microscope photonique

lectrons

Noir et blanc

Photons

Couleur (Lugol, rouge neutre)

Cellules mortes car fix es

Vivantes ou mortes.

2000 1000000

Pouvoir s parateur

4

Lentilles

Image re ue

Magn tiques

Sur cran fluorescent

25 1000

0.2 m

En verre

Par lSil

Pr parations coup es

A lultramicrotome

Au microtome

1.4. Autres microscopes

1.4.1. Microscope lectronique balayage

Cest le microscope dobservation des surfaces et permet dobtenir une image en relief de la surface de

l chantillon. La surface cellulaire est recouverte par une mince couche dor, de platine ou de palladium

pour emp cher la travers e des lectrons. Un faisceau d lectrons balaye la surface ce qui provoque une

mission d lectrons qui sont capt s par l cran. Langle dimpact du faisceau d lectrons avec la surface

cellulaire varie. Limage ainsi reconstitu e est tridimensionnelle.

1.4.2. Microscope pifluorescence

Cet appareil permet danalyser la lumi re r mise par fluorescence par un chantillon clair par une

lumi re dune longueur donde donn e. Il est tr s utile pour analyser aussi bien des substances

fluorescentes naturellement (comme la chlorophylle) que des substances fluorescentes fix es

artificiellement sur des mol cules comme marqueurs.

23

2. M thodes d'analyse des constituants cellulaires

De mani re g n rale, ces m thodes d'analyse ont un double objectif :

Etablir un catalogue des mol cules constituant un chantillon biologique donn ,

ind pendamment de leur fonction

Rep rer dans une fraction, ou localiser dans une structure, une seule esp ce mol culaire connue,

d j identifi e, dans le cadre d'une approche plus cibl e, fonctionnelle/

2.1. Fractionnement chimique

Cest un ensemble de techniques qui consistent s parer les petites mol cules (organiques ou min rales)

des macromol cules.

Lorsquun extrait biologique brut, tel qu'un homog nat, est trait par un acide fort froid, les

macromol cules (en particulier, les prot ines) sont d natur es et forment des pr cipit s faciles

s dimenter par centrifugation. Le surnageant contient tous les pr curseurs organiques solubles dans

lacide : acides amin s, glucides, nucl otides, produits de d gradation..., ainsi que les ions min raux.

La m thode de tamisage mol culaire, relativement r cente et plus r solutive, permet de s parer ais ment

les macromol cules natives en solution des compos s de faible masse mol culaire (sels min raux ou

pr curseurs organiques), par filtration sur gel . Cette technique consiste en une chromatographie sur

colonne utilisant un gel poreux form de microbilles de nature polysaccharidique ; il s'agit d'une filtration

par exclusion car les plus grosses mol cules sont lu es les premi res et donc s par es des autres.

2.2. M thodes de s paration: chromatographie et

lectrophor se

La chromatographie est une m thode s parative qui

permet lidentification et le dosage des diff rents compos s

dun m lange. Le principe est bas sur les propri t s de

solubilit diff rentielle des compos s dans des solvants ou

des m langes de solvants vari s. Chaque esp ce chimique

se d place une vitesse propre

d pendant de ses

caract ristiques et de celles des deux phases mobile et/ou

stationnaire. La chromatographie permet donc de s parer

les constituants d'un m lange homog ne.

Il existe diff rents types de chromatographies suivant la

m thode de s paration utilis e: dadsorption, de partage,

d change dions, d'exclusion.

24

La chromatographie sur couche mince (CCM), par exemple, est une technique physique de s paration

d'esp ces chimiques. Pour cela on utilise un luant: solvant qui monte par capillarit le long du support

entra nant ainsi les diff rentes esp ces chimiques.

Dans certains cas, le partage se fait plus facilement par chromatographie de partage bidimensionnelle :

une premi re chromatographie dans un premier syst me de solvants est suivie par une deuxi me

migration dans un syst me de solvants diff rent effectu e

sur la plaque pr alablement s ch e et tourn e de 90 .

les constituants du m lange sont r partis sur toute la

surface de la plaque et donc mieux s par s qu'apr s une

migration monodimensionnelle.

L lectrophor se est bas e sur les diff rences de charge

lectrique. Elles permettent ais ment de s parer les sucres

simples, les acides amin s, les acides organiques et les

acides gras, les nucl otides... Cest aussi une m thode

int ressante pour s parer, en pr sence d'un champ

les milliers d'esp ces

lectrique,

mol culaires de prot ines et d'acides nucl iques

constituant les m langes naturellement rencontr s dans les

cellules.

les centaines ou

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3. S paration de diff rents organites : le fractionnement cellulaire

Cest une technique qui permet disoler les organites cellulaires tout en conservant intactes leur structure

et leurs propri t s physiologiques. Les organites cellulaires obtenus par cette technique sont vivants et

fonctionnels. On peut faire une analyse chimique pour tudier leur composition et tudier leur fonction in

vitro dans un milieu synth tique.

comporte 3 tapes :

Cette technique

u Broyage (homog n isation) : le tissu cellulaire est broy dans les conditions suivantes :

• Dans une solution de saccharose isotonique par rapport au milieu intracellulaire pour viter les

changes deau.

26

• Dans une solution pH constant pour viter les changes de protons.

• A 0 c pour annuler lactivit enzymatique.

On obtient une suspension ou homog nat o sont dispers s les organites cellulaires vivants.

u Centrifugation diff rentielle : lhomog nat est soumis une premi re centrifugation br ve et

faible vitesse. Celle-ci fait s dimenter les organites les plus lourds (noyaux) qui se s parent dun

liquide appel surnageant contenant les particules les plus l g res. Le surnageant est centrifug

nouveau plus longtemps avec une vitesse plus lev e etc.& Le dernier surnageant est le

hyaloplasme, il contient des prot ines (des enzymes lib r s par le broyage), des acides amin s

mais pas dorganites.

u Purification des constituants cellulaires par centrifugation en gradient de densit : la

centrifugation en

gradient de densit

permet la s paration

compl te des

organites. Pour cela,

on introduit dans le

tube des solutions de

saccharose dont la

concentration molaire

augmente du haut vers

le bas (gradient), on tale en une fine couche la fraction purifier sur la derni re solution de

saccharose puis on centrifuge. Selon leur densit , les organites migrent dans le tube et se

stabilisent dans des zones de saccharose de densit identique celle du constituant cellulaire. Les

organites isol s sont r cup r s.

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4. La culture cellulaire

La culture cellulaire est un ensemble de techniques de biologie utilis es pour faire cro tre des cellules

hors de leur organisme (ex-vivo) ou de leur milieu d'origine, dans un but d'exp rimentation

scientifique ou de f condation in vitro.

Les microorganismes procaryotes (Bact ries, Cyanobact ries...) ou eucaryotes unicellulaires

(Protistes

: Amoeba, Paramecium, Tetrahymena..., Algues

: Chlamydomonas, Chlorella,

Micrasterias... ou Champignons : levure de bi re...) se cultivent ais ment, dans des milieux

synth tiques sp cifiques parfaitement contr l s et dans des conditions g n ralement simples. Ces

milieux sont liquides ou solides, apr s g lification au moyen de compos s inertes tels que l'agar-agar.

La culture in vitro de cellules d'organismes sup rieurs, animaux ou v g taux, pose davantage de

probl mes dans la mesure o , contrairement aux pr c dentes, ces cellules sont normalement

int gr es au sein d'un organisme et donc le plus souvent tributaires, pour leur croissance,

d'interactions avec d'autres cellule.

Dans cette partie, nous allons d velopper la culture des cellules animales. Les autres types de cultures

seront d velopp s dans dautres modules.

4.1. Source des cellules

Il sagit de diff rentes cat gories de cellules : cellules normales, cellules transform es, cellules

tumorales& Le choix d pend de lobjectif de la culture.

4.2. Milieux de culture

Les cellules doivent tre plac es dans des milieux de culture qui permettent de les nourrir et leur assurer

de bonnes conditions de survie. En m me temps, le milieu comprend des substances qui stimulent la

multiplication et le d veloppement des cellules.

n Exigences cellulaires minimales apport s par des base communes (milieux Hanks, Earl, PBS,

Gey)

n eau

n ions min raux donnant une osmolarit identique celle du s rum physiologique

n source de carbone et d' nergie (glucose par exemple)

n source d'azote : acides amin s

n source dacides gras

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n pH constant 7,4 (indicateur de pH : rouge de ph nol) gr ce un syst me tampon

CO2/HCO3

• ou phosphates.

n Compl ments variables selon les milieux (RPMI, MEM, DMEM&) : acides amin s, vitamines,

cofacteurs, bases azot es, ribose et d soxyribose.

n facteurs de croissance cellulaire (apport s parfois par le serum de bSuf fStal)

n EGF (facteur de croissance pidermique),

n FGF (facteur de croissance fibroblastique)

n PDGF (facteur de croissance d riv des plaquettes)

n Facteurs de diff renciation comme fibronectine (ancrage des cellules).

n Inhibiteurs comme lalpha1 antitrypsine (neutralisation de laction enzymatique de

la trypsine).

4.3. Conditions de mise en culture

La culture est tr s sensible aux contaminations. La culture des cellules doit se faire dans des conditions

garantissant labsence de toute forme de contamination par dautres

cellules comme les microorganismes. Cest ce quon appelle conditions

de st rilit ou dasepsie. Un ensemble de pr cautions sont ainsi prises

toutes les tapes de la culture.

Le mat riel et les milieux utilis s pour la culture sont st rilis s par :

• Lutilisation de lautoclave la temp rature de 121 C et une

pression de 1 Kba.

• Certains milieux fragiles sont pass s dans des filtres millipores.

• Certains r cipients en plastique sont garantis st riles par le

fabricant.

• Certains milieux comprennent des antibiotiques.

La culture de cellules impose l'utilisation de la hotte flux laminaire ou poste de s curit

microbiologique afin d viter la contamination pendant le travail densemencement et/ou de repiquage.

Le PSM est une enceinte qui permet de travailler st rilement SANS FLAMME. L'air y est constamment

filtr par des filtres absolus. Le mouvement de l'air, assur par un puissant ventilateur, permet d' tablir un

flux laminaire d'air st rile sur le plan de travail. La protection de l'op rateur est assur e par une vitre

l'avant de l'enceinte: il pourra ainsi viter sa contamination par les virus manipul s ou par les cellules

dont les acides nucl iques pourraient ventuellement lui tre transmis.

29

Le PSM est aussi utilis dans la culture des tissus v g taux et dans des installations industrielles, pour la

fabrication de composants lectroniques et des disques c d rom ou

DVD.

Au sein de la hotte, des pr cautions suppl mentaires doivent tre

prises :

• Une petite flamme ou un syst me de st rilisation thermique

permet de st riliser les instruments comme les pinces les

ciseaux &

• Le pipetage doit se faire soit par le syst me Pipet aid , soit par

les syst mes c nes st riles.

4.4. Conditions dincubation des cultures

La fragilit des cultures cellulaires impose le contr le strict des conditions de lenvironnement. Ainsi, en

g n ral, les r cipients sont plac s dans les conditions suivantes :

37 C

84% d'humidit

5% de CO2, le CO2 formant syst me tampon avec HCO3- du milieu et permettant ainsi un

maintien du pH de la culture 7,2-7,3 (ce qui est attest par le rouge de ph nol).

Ces conditions sont assur es par un incubateur CO2 ( tuve CO2). Cet incubateur pr sente les avantages

suivants :

o

temp rature contr l e comme pour un tuvage classique

o hygrom trie contr l e

o CO2 contr l e

4.5. Diff rents types de cultures

On distingue :

des cultures primaires issues de la multiplication de cellules (souvent de nature embryonnaire)

pr lev es directement dans les organismes, apr s que leurs tissus aient t dissoci s par des enzymes

30

appropri es (prot ases). La multiplication de ces cellules s arr te lorsque la surface du milieu est

couverte : cest linhibition de contact.

des cultures secondaires, qui r sultent du repiquage de cellules issues de cultures primaires, apr s

dilution et ensemencement dans du milieu nutritif neuf. Ces cultures sont terme condamn es

mourir, comme celles de l'organisme de d part, apr s environ 50 100 divisions: on parle de souches

cellulaires ;

des lign es cellulaires

ou

cellules

immortelles

ayant

perdu linhibition de

contact et peuvent se

multiplier

ind finiment suite

des

mutations

spontan es

(ponctuelles

ou

r arrangements chromosomiques) ou gr ce des agents chimiques ou physiques mutag nes, par des

Virus ou bien par des manipulations g n tiques (transfection d'ADN purifi ).

Parmi les lign es cellulaires immortalis es, on distingue enfin des lign es dites transform es, qui

induisent des tumeurs si on injecte leurs cellules des animaux sains.

4.6. Int r t des cellules en culture

Lexamen des cellules en culture a apport une contribution consid rable la connaissance du

fonctionnement de la cellule. Ces techniques permettent en effet:

Dans les recherches fondamentales pour l tude des ph nom nes de diff renciation, de

d diff renciation, les m canismes du cycle cellulaire&

dans l'industrie pour des tudes de toxicologie (notamment en raison des probl mes

d'exp rimentation animale, exp rimentation animale qui ne peut malgr tout pas tre supprim e

car les effets sur l'animal entier ne sont pas les m mes que sur des cellules isol es),

Dans le domaine de la sant pour les tudes chromosomiques (caryotype fStal), la production

de peau neuve par culture pour autogreffe ult rieure (pour les grands br l s), la culture des virus

(production de vaccin ou diagnostic).

31

5. Marquage des mol cules

5.1. D finition

Le marquage des mol cules est la fixation, sur une mol cule, d'un signe de reconnaissance facilement

identifiable qui autorise le suivi d'un compos dans un organisme, un organe, un tissu ou dans la cellule.

Le marquage utilise soit les isotopes radioactifs (autohistoradiographie), soit des compos s fluorescents.

5.2. Techniques immunocytochimiques

Limmunocytochimie est l'application la cellule de techniques fond es sur l'antig nicit des prot ines

afin de les localiser de mani re sp cifique et de suivre leur volution. .

5.2.1. Pr paration des anticorps

Un anticorps sp cifique de l'antig ne (prot ine) tudier, est pr par

par injection de cet antig ne purifi un animal appartenant une

autre esp ce que celle dont on a extrait l'antig ne inject . Lanimal

trait synth tise un

'anticorps sp cifique contre cet antig ne.

Lanticorps ainsi obtenu se fixe sur la prot ine qui est l'origine de sa

fabrication.

5.2.2. Marquage de l'anticorps

Afin de visualiser le complexe antig ne-anticorps, on associe l'anticorps un syst me marqueur (ou

r v lateur) compos d'une mol cule d tectable en microscopie:

une substance fluorescente (par exemple l'isothiocyanate de fluoresc ine)

une enzyme (peroxydase du raifort, phosphatase alcaline) lorigine de la production dun

pr cipit color .

marqueurs

m talliques (ferritine,

or collo dal) utilis s

essentiellement

en

microscopie

lectronique.

32

5.2.3. Techniques de d tection

Immunocytochimie directe: Les anticorps rep rables par leur marqueur se fixent sur leur

antig ne. Le complexe antig ne-anticorps-marqueur est alors d tectable en microscopie.

Immunocytochimie indirecte: elle permet d'augmenter la sensibilit de la r action, en combinant

deux types d'anticorps: les anticorps anti-prot ine (anticorps primaires) qui ne sont pas porteurs

de marqueurs et des anticorps anti-anticorps primaires (anticorps secondaires) porteurs de

marqueurs. La pr paration est d'abord trait e par des anticorps primaires: ils se combinent avec la

prot ine X puis les

anticorps secondaires

se fixent alors sur les

anticorps primaires.

5.2.4. Exemple

dapplication :

la mobilit des

prot ines

On injecte un lapin des

cellules de souris maintenues

en culture in vitro. Le lapin

r agit en produisant des

anticorps

anti-cellule

de

souris. Ces anticorps sont

marqu s la fluoresceine

(fluorescence

verte

au

microscope lumi re U-V).

On injecte un autre lapin

des cellules d'homme en

culture. Le lapin r agit en

produisant

des

anticorps

anti-cellule d'homme, ces anticorps seront marqu s la rhodamine (fluorescence rouge au microscope

lumi re U-V).

33

On provoque la fusion entre les cellules de souris et les cellules humaines. Il se forme des h t rocaryons

contenant chacun un noyau de souris et un noyau humain.

Au temps T=0mn: on ajoute l'h t rocaryon un m lange d'anticorps marqu s par la rhodamine et la

fluoresc ine, pour identifier la position des glycoprot ines (antig nes) de l'homme et de la souris dans la

membrane de l'h t rocaryon ;

5mn apr s l'addition du m lange d'anticorps marqu s, on observe au microscope U-V, une fluorescence

rouge d'un h misph re de l'h t rocaryon et une fluorescence verte de l'autre h misph re. Donc les

anticorps marqu s se sont fix s sur les antig nes correspondants c d les glycoprot ines membranaires.

40 mn apr s l'addition des anticorps marqu s, on observe au microscope U-V, une fluorescence

homog ne (verte et rouge) sur toute la surface de l&...