Cours de biologie cellulaire

vivante. Ses rôles les plus importants sont :

 C’est le solvant de beaucoup de substances

cellulaires.

 C’est le milieu où se déroule la quasi-totalité des

réactions biologiques.

 Il peut participer comme substrat (réactif) ou se

libérer comme produit dans certaines réactions

comme l’hydrolyse.

 Il contribue, par son interaction avec les molécules hydrophiles et/ou hydrophobes, à stabiliser

beaucoup de structures cellulaires comme les membranes.

2. Les substances organiques

Ce sont des molécules dont l’atome principal est le carbone. La molécule la plus simple est le méthane

qui comprend un atome de carbone associé à 4 atome d’hydrogène.

Il existe quatre types de molécules organiques:

 Les glucides

 Les lipides

 Les protéines

 Les acides nucléiques

13

2.1. Les glucides

Les glucides comprennent les sucres et leurs polymères. Les

glucides comprennent le carbone, l’oxygène et l’hydrogène. Le

nom des glucides se termine par ose.

On distingue :

 Les monosaccharides: ce sont les glucides les plus simples

avec une formule chimique constituée d’un multiple de

CH2O. Le plus connu est le glucose.

 Les disaccharides: c’est l’association de deux

monosaccharides. Le plus connu est le

saccharose.

 Les polysaccharides: C’est l’association d’un

grand nombre de monosaccharides pour

former des polymères.

Exemple 1: l’amidon qui constitue la forme de

réserve dans les graines (haricot) ou les

tubercules.

Exemple 2: la cellulose qui est le principal

constituant de la paroi végétale

14

Les principaux rôles des glucides sont :

 Source d’énergie pour la cellule

 Entrent dans la composition des acides nucléiques

 Composent la paroi des cellules végétales et bactériennes

 Font partie de la membrane plasmique où ils jouent, entre autres, le rôle dans l’adhérence et la

reconnaissance cellulaires

2.2. Les lipides

Ce sont des molécules hydrophobes ou amphiphiles(molécules hydrophobes possédant un

domaine hydrophile) très diversifiées. Ils Comprennent entre autres les graisses, les cires, les stérols

les vitamines liposolubles, les mono-, di- et triglycérides, ou encore les phospholipides.

Dans le cadre de ce cours nous

nous limiterons à l’étude des

acides gras et leurs

associations en triglycérides et

en phospholipides

Les acides gras sont de

longues chaînes carbonées à nombre pair de carbones et portant une fonction acide au niveau du carbone

1.

15

Ces acides gras peuvent être:

 Saturés s’ils ne comprennent que des simples liaisons.



Insaturés s’ils portent au moins une double ou triple liaison.

Les acides gras peuvent réagir avec une

molécule de glycérol peuvent former

soit un triglycéride.

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L’association du glycérol avec deux acides gras et un groupement phosphate associé à un groupement

hydrophile donne un lipide amphiphile: c’est un phospholipide.

Les rôles des lipides sont multiples. On peut citer entre autres :

 Constitution de la bicouche lipidique des membranes.

 Source importante d’énergie pour la cellule

 Forme de réserves chez les végétaux (graines oléagineuses) et chez les animaux (tissus adipeux)

 Constitution des hormones lipophiles.

2.3. Les protéines

Les protéines sont des chaînes d’acides aminés

reliés entre eux par des liaisons peptidiques

CO-NH.

Un acide aminé est une molécule carbonée

comprenant un groupe carboxyle (-COOH), un

groupe amine (-NH2) et une chaîne latérale

variable (-R) qui diffère entre les 20 acides aminés.

17

Les acides

aminés peuvent

avoir

différentes

propriétés

selon la nature

de leur chaîne

latérale.

La synthèse des

protéines passe

par la formation d’une liaison covalente dite liaison peptidique entre les acides aminés pour former une

chaîne linéaire d’acides aminés. La succession des acides aminés varie d’une protéine à l »autre. On

parle de séquence primaire. Différentes interactions au sein des chaînes peptidiques donnent une

structure secondaire, tertiaire puis quaternaire aboutissant à une structure tridimensionnelle particulière

permettant la fonctionnalité de la protéine.

Les rôles des protéines sont très nombreux. On peut les classer en 2 catégories :

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 Protéines de structure: beaucoup de protéines participent à différentes structures cellulaires

comme les membranes, le cytosquelette et d’autres.

 Protéines enzymatiques : les réactions de la cellule vivante sont catalysées par des protéines

appelées enzymes.

2.4. Les acides nucléiques

Voir plus loin

3. Sels minéraux

Les sels minéraux sont les constituants qui restent (sous forme de cendres) après calcination des tissus

organiques.

Chimiquement, ce sont des éléments ionisés chargés soit positivement (cations) ou négativement

(anions).

Les sels minéraux sont essentiels à l'organisme, notamment parce qu'ils :

- contrôlent l'équilibre hydrique (pression osmotique)

- règlent l'équilibre acide-base (pH)

- font partie de certaines structures (os, dents)

- entrent dans la composition des enzymes, des hormones

- catalysent de nombreuses réactions du métabolisme

Selon les quantités mises en jeu dans l'organisme, les sels minéraux sont couramment

divisés en 2 groupes:

- les éléments principaux ou macroéléments: Ca, P, K, Cl, Na, Mg

- les éléments traces ou oligoéléments: Fe, Zn, Cu, Mn, I, Mo, etc.

19

Chapitre 3

Méthodes d’étude de la cellule

1. La microscopie

Le microscope à transmission (photonique ou

électronique) permet d’observer. sur une coupe

très fine les détails infiniment petits d’un objet

(animal, plante, roche).

1.1. Le microscope optique

La figure ci-contre montre un microscope optique

et ses différentes composantes. Il permet de

visualiser des objets très fins, montés dans une

goutte d’eau ou de liquide coloré sur une lame

porte objet et recouvert d’une lamelle couvre objet

très fragile, ou des coupesfixées et colorées selon

un protocole qui sera présenté ultérieurement. La

lumière qui traverse l’objet remonte dans les

lentilles de verre (objectif et oculaire) ce qui

agrandit l’objet.

L’observation au microscope passe par les étapes

suivantes :

 Préparation de

l’observation:

la

préparation à observer est placée sur la

platine et centrée pour que la lumière

traverse le tube optique donnant un

rond lumineux dans l’oculaire.

 La mise au point: le petit objectif

(faible grossissement) est placé dans

l’axe du tube optique. Il faut ensuite

regarder dans l’oculaire et, à l’aide de

20

la vis macrométrique de mise au point, remonter le tube jusqu’à l’obtention d’une image

nette.

 Exploration de la préparation : la préparation est déplacée délicatement jusqu’à trouver

l’objet recherché.

 Changement de grossissement: il faut placer la zone à agrandir au centre de la platine, puis

changer d’objectif en tournant le barillet, sans toucher au réglage précédent. Le changement

d’objectif se fait toujours du plus faible au plus fort grossissement. La nouvelle mise au point

se fait seulement par la petite vis.

Que faire pour ne pas endommager les préparations ?

 Toujours commencer l’observation avec l’objectif le plus faible.

 N’utiliser la vis macrométrique (la grosse) qu’à faible grossissement.

 Fixer la lame avec les valets : si l’un d’eux est manquant, ne pas incliner le microscope!

 Ne jamais descendre le tube sans surveiller la platine et la lame en regardant sur le côté.

 Aux grossissements supérieurs, n’utiliser que la vis micrométrique.

 Si la vis semble bloquée, il faut s’assurer

que l’objectif n’appuie pas sur la lame.

1.2. Microscope électronique à transmission

1.2.1. Principe du fonctionnement

Il est comparable à celui du microscope photonique.

La source S est une cathode qui émet des électrons (au

lieu des photons) qui sont accélérés par

l’application d’une différence de potentiel entre la

cathode et l’anode (60 à 100 Kv). Le vide poussé à

l’intérieur du ME est nécessaire au déplacement des

électrons. Les électrons traversent 3 lentilles

électromagnétiques L1, L2, L3 et l’objet AB.

- L1 : le condensateur permet de focaliser le

flux d’électrons sur l’objet.

- L2 et L3 jouent le rôle d’objectif et permettent

l’agrandissement de l’objet AB.

21

L’image est observée directement sur l’écran rendu fluorescent par le bombardement électronique ou sur

une plaque photographique. Le MET permet des grossissements allant de 2000 à un million.

1.2.2. Préparation des coupes cellulaires ultrafines

Les cellules doivent être coupées en tranches très fines (50 à 100 nm) pour permettre aux électrons de les

traverser, pour cela :

- Les cellules sont tuées par des fixateurs

(glutaraldéhyde, tétroxyde d’osmium) qui

préservent les structures cellulaires.

- Les échantillons fixés sont lavés dans

l’eau, puis déshydratés par des solvants

organiques (acétone).

- Les échantillons sont inclus dans une résine

(araldite).

- Les blocs de résine renfermant l’échantillon

sont coupés à l’aide d’un ultra microtome

muni d’un couteau de verre ou de diamant.

- Les coupes cellulaires sont recueillies sur

une grille en cuivre. La grille est trempée

dans une solution de métaux lourds

(uranium, plomb) pour noircir les structures

cellulaires et augmenter le contraste. La

grille est ensuite introduite dans le MET pour l’observation.

22

1.3. .Comparaison entre microscope électronique à transmission et microscope photonique

La figure ci-contre montre que les deux fonctionnent selon les mêmes principes. Les différences résident

dans la nature de la source (lampe ou cathode), la nature des lentilles (en verre ou électromagnétiques) et

en fin le mode d’observation : l’œil pour le microscope photonique et l’écran ou le cliché pour le

microscope électronique.

Source d’énergie

Couleur

Etat des cellules

Grossissement

Microscope électronique

Microscope photonique

électrons

Noir et blanc

Photons

Couleur (Lugol, rouge neutre)

Cellules mortes car fixées

Vivantes ou mortes.

2000 à 1000000

Pouvoir séparateur

4 Ǻ

Lentilles

Image reçue

Magnétiques

Sur écran fluorescent

25 à 1000

0.2 µm

En verre

Par l’œil

Préparations coupées

A l’ultramicrotome

Au microtome

1.4. Autres microscopes

1.4.1. Microscope électronique à balayage

C’est le microscope d’observation des surfaces et permet d’obtenir une image en relief de la surface de l’échantillon. La surface cellulaire est recouverte par une mince couche d’or, de platine ou de palladium pour empêcher la traversée des électrons. Un faisceau d’électrons balaye la surface ce qui provoque une émission d’électrons qui sont captés par l’écran. L’angle d’impact du faisceau d’électrons avec la surface cellulaire varie. L’image ainsi reconstituée est tridimensionnelle.

1.4.2. Microscope à épifluorescence

Cet appareil permet d’analyser la lumière réémise par fluorescence par un échantillon éclairé par une lumière d’une longueur d’onde donnée. Il est très utile pour analyser aussi bien des substances fluorescentes naturellement (comme la chlorophylle) que des substances fluorescentes fixées artificiellement sur des molécules comme marqueurs.

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2. Méthodes d'analyse des constituants cellulaires

De manière générale, ces méthodes d'analyse ont un double objectif :

 Etablir un catalogue des molécules constituant un échantillon biologique donné,

indépendamment de leur fonction

 Repérer dans une fraction, ou localiser dans une structure, une seule espèce moléculaire connue,

déjà identifiée, dans le cadre d'une approche plus ciblée, fonctionnelle/

2.1. Fractionnement chimique

C’est un ensemble de techniques qui consistent à séparer les petites molécules (organiques ou minérales) des macromolécules.

Lorsqu’un extrait biologique brut, tel qu'un homogénat, est traité par un acide fort à froid, les macromolécules (en particulier, les protéines) sont dénaturées et forment des précipités faciles à sédimenter par centrifugation. Le surnageant contient tous les précurseurs organiques solubles dans l’acide : acides aminés, glucides, nucléotides, produits de dégradation..., ainsi que les ions minéraux.

La méthode de tamisage moléculaire, relativement récente et plus résolutive, permet de séparer aisément les macromolécules natives en solution des composés de faible masse moléculaire (sels minéraux ou précurseurs organiques), par «filtration sur gel». Cette technique consiste en une «chromatographie» sur colonne utilisant un gel poreux formé de microbilles de nature polysaccharidique ; il s'agit d'une filtration par exclusion car les plus grosses molécules sont éluées les premières et donc séparées des autres.

2.2. Méthodes de séparation: chromatographie et

électrophorèse

La chromatographie est une méthode séparative qui permet l’identification et le dosage des différents composés d’un mélange. Le principe est basé sur les propriétés de solubilité différentielle des composés dans des solvants ou des mélanges de solvants variés. Chaque espèce chimique se déplace à une vitesse propre dépendant de ses caractéristiques et de celles des deux phases mobile et/ou stationnaire. La chromatographie permet donc de séparer les constituants d'un mélange homogène. Il existe différents types de chromatographies suivant la méthode de séparation utilisée: d’adsorption, de partage, d’échange d’ions, d'exclusion.

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La chromatographie sur couche mince (CCM), par exemple, est une technique physique de séparation d'espèces chimiques. Pour cela on utilise un éluant: solvant qui monte par capillarité le long du support entraînant ainsi les différentes espèces chimiques.

Dans certains cas, le partage se fait plus facilement par chromatographie de partage bidimensionnelle : une première chromatographie dans un premier système de solvants est suivie par une deuxième migration dans un système de solvants différent effectuée sur la plaque préalablement séchée et tournée de 90°. les constituants du mélange sont répartis sur toute la surface de la plaque et donc mieux séparés qu'après une migration monodimensionnelle.

L’électrophorèse est basée sur les différences de charge électrique. Elles permettent aisément de séparer les sucres simples, les acides aminés, les acides organiques et les acides gras, les nucléotides... C’est aussi une méthode intéressante pour séparer, en présence d'un champ les milliers d'espèces électrique, moléculaires de protéines et d'acides nucléiques constituant les mélanges naturellement rencontrés dans les cellules.

les centaines ou

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3. Séparation de différents organites : le fractionnement cellulaire

C’est une technique qui permet d’isoler les organites cellulaires tout en conservant intactes leur structure

et leurs propriétés physiologiques. Les organites cellulaires obtenus par cette technique sont vivants et

fonctionnels. On peut faire une analyse chimique pour étudier leur composition et étudier leur fonction in

vitro dans un milieu synthétique.

comporte 3 étapes :

Cette technique

 Broyage (homogénéisation) : le tissu cellulaire est broyé dans les conditions suivantes :

- Dans une solution de saccharose isotonique par rapport au milieu intracellulaire pour éviter les

échanges d’eau.

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- Dans une solution à pH constant pour éviter les échanges de protons.

- A 0°c pour annuler l’activité enzymatique.

On obtient une suspension ou homogénat où sont dispersés les organites cellulaires vivants.

 Centrifugation différentielle : l’homogénat est soumis à une première centrifugation brève et à

faible vitesse. Celle-ci fait sédimenter les organites les plus lourds (noyaux) qui se séparent d’un

liquide appelé surnageant contenant les particules les plus légères. Le surnageant est centrifugé à

nouveau plus longtemps avec une vitesse plus élevée etc.… Le dernier surnageant est le

hyaloplasme, il contient des protéines (des enzymes libérés par le broyage), des acides aminés

mais pas d’organites.

 Purification des constituants cellulaires par centrifugation en gradient de densité : la

centrifugation en

gradient de densité

permet la séparation

complète des

organites. Pour cela,

on introduit dans le

tube des solutions de

saccharose dont la

concentration molaire

augmente du haut vers

le bas (gradient), on étale en une fine couche la fraction à purifier sur la dernière solution de

saccharose puis on centrifuge. Selon leur densité, les organites migrent dans le tube et se

stabilisent dans des zones de saccharose de densité identique à celle du constituant cellulaire. Les

organites isolés sont récupérés.

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4. La culture cellulaire

La culture cellulaire est un ensemble de techniques de biologie utilisées pour faire croître des cellules

hors de leur organisme (ex-vivo) ou de leur milieu d'origine, dans un but d'expérimentation

scientifique ou de fécondation in vitro.

Les microorganismes procaryotes (Bactéries, Cyanobactéries...) ou eucaryotes unicellulaires

(Protistes

: Amoeba, Paramecium, Tetrahymena..., Algues

: Chlamydomonas, Chlorella,

Micrasterias... ou Champignons : levure de bière...) se cultivent aisément, dans des milieux

synthétiques spécifiques parfaitement contrôlés et dans des conditions généralement simples. Ces

milieux sont liquides ou solides, après gélification au moyen de composés inertes tels que l'agar-agar.

La culture in vitro de cellules d'organismes supérieurs, animaux ou végétaux, pose davantage de

problèmes dans la mesure où, contrairement aux précédentes, ces cellules sont normalement

intégrées au sein d'un organisme et donc le plus souvent tributaires, pour leur croissance,

d'interactions avec d'autres cellule.

Dans cette partie, nous allons développer la culture des cellules animales. Les autres types de cultures

seront développés dans d’autres modules.

4.1. Source des cellules

Il s’agit de différentes catégories de cellules : cellules normales, cellules transformées, cellules

tumorales… Le choix dépend de l’objectif de la culture.

4.2. Milieux de culture

Les cellules doivent être placées dans des milieux de culture qui permettent de les nourrir et leur assurer

de bonnes conditions de survie. En même temps, le milieu comprend des substances qui stimulent la

multiplication et le développement des cellules.

 Exigences cellulaires minimales apportés par des base communes (milieux Hanks, Earl, PBS,

Gey)

 eau

 ions minéraux donnant une osmolarité identique à celle du sérum physiologique

 source de carbone et d'énergie (glucose par exemple)

 source d'azote : acides aminés

 source d’acides gras

28

 pH constant 7,4 (indicateur de pH : rouge de phénol) grâce un système tampon

CO2/HCO3

- ou phosphates.

 Compléments variables selon les milieux (RPMI, MEM, DMEM…) : acides aminés, vitamines,

cofacteurs, bases azotées, ribose et désoxyribose.

 facteurs de croissance cellulaire (apportés parfois par le serum de bœuf fœtal)

 EGF (facteur de croissance épidermique),

 FGF (facteur de croissance fibroblastique)

 PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes)

 Facteurs de différenciation comme fibronectine (ancrage des cellules).

 Inhibiteurs comme l’alpha1 antitrypsine (neutralisation de l’action enzymatique de

la trypsine).

4.3. Conditions de mise en culture

La culture est très sensible aux contaminations. La culture des cellules doit se faire dans des conditions garantissant l’absence de toute forme de contamination par d’autres cellules comme les microorganismes. C’est ce qu’on appelle conditions de stérilité ou d’asepsie. Un ensemble de précautions sont ainsi prises à toutes les étapes de la culture.

Le matériel et les milieux utilisés pour la culture sont stérilisés par :

- L’utilisation de l’autoclave à la température de 121°C et une

pression de 1 Kba.

- Certains milieux fragiles sont passés dans des filtres millipores.

- Certains récipients en plastique sont garantis stériles par le

fabricant.

- Certains milieux comprennent des antibiotiques.

La culture de cellules impose l'utilisation de la hotte à flux laminaire ou poste de sécurité

microbiologique afin d’éviter la contamination pendant le travail d’ensemencement et/ou de repiquage.

Le PSM est une enceinte qui permet de travailler stérilement SANS FLAMME. L'air y est constamment

filtré par des filtres absolus. Le mouvement de l'air, assuré par un puissant ventilateur, permet d'établir un

flux laminaire d'air stérile sur le plan de travail. La protection de l'opérateur est assurée par une vitre à

l'avant de l'enceinte: il pourra ainsi éviter sa contamination par les virus manipulés ou par les cellules

dont les acides nucléiques pourraient éventuellement lui être transmis.

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Le PSM est aussi utilisé dans la culture des tissus végétaux et dans des installations industrielles, pour la

fabrication de composants électroniques et des disques cédérom ou

DVD.

Au sein de la hotte, des précautions supplémentaires doivent être

prises :

- Une petite flamme ou un système de stérilisation thermique

permet de stériliser les instruments comme les pinces les

ciseaux …

- Le pipetage doit se faire soit par le système Pipet aid , soit par

les systèmes à cônes stériles.

4.4. Conditions d’incubation des cultures

La fragilité des cultures cellulaires impose le contrôle strict des conditions de l’environnement. Ainsi, en

général, les récipients sont placés dans les conditions suivantes :

 37°C

 84% d'humidité

 5% de CO2, le CO2 formant système tampon avec HCO3- du milieu et permettant ainsi un

maintien du pH de la culture à 7,2-7,3 (ce qui est attesté par le rouge de phénol).

Ces conditions sont assurées par un incubateur CO2 (étuve à CO2). Cet incubateur présente les avantages

suivants :

o

température contrôlée comme pour un étuvage classique

o hygrométrie contrôlée

o CO2 contrôlée

4.5. Différents types de cultures

On distingue :

 des cultures primaires issues de la multiplication de cellules (souvent de nature embryonnaire)

prélevées directement dans les organismes, après que leurs tissus aient été dissociés par des enzymes

30

appropriées (protéases). La multiplication de ces cellules s »arrête lorsque la surface du milieu est

couverte : c’est l’inhibition de contact.

 des cultures secondaires, qui résultent du repiquage de cellules issues de cultures primaires, après

dilution et ensemencement dans du milieu nutritif neuf. Ces cultures sont à terme condamnées à

mourir, comme celles de l'organisme de départ, après environ 50 à 100 divisions: on parle de souches

cellulaires ;

 des lignées cellulaires

ou

cellules

immortelles

ayant

perdu l’inhibition de

contact et peuvent se

multiplier

indéfiniment suite à

des

mutations

spontanées

(ponctuelles

ou

réarrangements chromosomiques) ou grâce à des agents chimiques ou physiques mutagènes, par des

Virus ou bien par des manipulations génétiques (transfection d'ADN purifié).

 Parmi les lignées cellulaires immortalisées, on distingue enfin des lignées dites transformées, qui

induisent des tumeurs si on injecte leurs cellules à des animaux sains.

4.6. Intérêt des cellules en culture

L’examen des cellules en culture a apporté une contribution considérable à la connaissance du

fonctionnement de la cellule. Ces techniques permettent en effet:

 Dans les recherches fondamentales pour l’étude des phénomènes de différenciation, de

dédifférenciation, les mécanismes du cycle cellulaire…

 dans l'industrie pour des études de toxicologie (notamment en raison des problèmes

d'expérimentation animale, expérimentation animale qui ne peut malgré tout pas être supprimée

car les effets sur l'animal entier ne sont pas les mêmes que sur des cellules isolées),

 Dans le domaine de la santé pour les études chromosomiques (caryotype fœtal), la production

de peau neuve par culture pour autogreffe ultérieure (pour les grands brûlés), la culture des virus

(production de vaccin ou diagnostic).

31

5. Marquage des molécules

5.1. Définition

Le marquage des molécules est la fixation, sur une molécule, d'un signe de reconnaissance facilement

identifiable qui autorise le suivi d'un composé dans un organisme, un organe, un tissu ou dans la cellule.

Le marquage utilise soit les isotopes radioactifs (autohistoradiographie), soit des composés fluorescents.

5.2. Techniques immunocytochimiques

L’immunocytochimie est l'application à la cellule de techniques fondées sur l'antigénicité des protéines

afin de les localiser de manière spécifique et de suivre leur évolution. .

5.2.1. Préparation des anticorps

Un anticorps spécifique de l'antigène (protéine) à étudier, est préparé

par injection de cet antigène purifié à un animal appartenant à une

autre espèce que celle dont on a extrait l'antigène injecté. L’animal

traité synthétise un

'anticorps spécifique contre cet antigène.

L’anticorps ainsi obtenu se fixe sur la protéine qui est à l'origine de sa

fabrication.

5.2.2. Marquage de l'anticorps

Afin de visualiser le complexe antigène-anticorps, on associe à l'anticorps un système marqueur (ou

révélateur) composé d'une molécule détectable en microscopie:

 une substance fluorescente (par exemple l'isothiocyanate de fluorescéine)

 une enzyme (peroxydase du raifort, phosphatase alcaline) à l’origine de la production d’un

précipité coloré.

 marqueurs

métalliques (ferritine,

or colloïdal) utilisés

essentiellement

en

microscopie

électronique.

32

5.2.3. Techniques de détection

 Immunocytochimie directe: Les anticorps repérables par leur marqueur se fixent sur leur

antigène. Le complexe antigène-anticorps-marqueur est alors détectable en microscopie.

 Immunocytochimie indirecte: elle permet d'augmenter la sensibilité de la réaction, en combinant

deux types d'anticorps: les anticorps anti-protéine (anticorps primaires) qui ne sont pas porteurs

de marqueurs et des anticorps anti-anticorps primaires (anticorps secondaires) porteurs de

marqueurs. La préparation est d'abord traitée par des anticorps primaires: ils se combinent avec la

protéine X puis les

anticorps secondaires

se fixent alors sur les

anticorps primaires.

5.2.4. Exemple

d’application :

la mobilité des

protéines

On injecte à un lapin des

cellules de souris maintenues

en culture in vitro. Le lapin

réagit en produisant des

anticorps

anti-cellule

de

souris. Ces anticorps sont

marqués à la fluoresceine

(fluorescence

verte

au

microscope à lumière U-V).

On injecte à un autre lapin

des cellules d'homme en

culture. Le lapin réagit en

produisant

des

anticorps

anti-cellule d'homme, ces anticorps seront marqués à la rhodamine (fluorescence rouge au microscope à

lumière U-V).

33

On provoque la fusion entre les cellules de souris et les cellules humaines. Il se forme des hétérocaryons

contenant chacun un noyau de souris et un noyau humain.

Au temps T=0mn: on ajoute à l'hétérocaryon un mélange d'anticorps marqués par la rhodamine et la

fluorescéine, pour identifier la position des glycoprotéines (antigènes) de l'homme et de la souris dans la

membrane de l'hétérocaryon ;

5mn après l'addition du mélange d'anticorps marqués, on observe au microscope à U-V, une fluorescence

rouge d'un hémisphère de l'hétérocaryon et une fluorescence verte de l'autre hémisphère. Donc les

anticorps marqués se sont fixés sur les antigènes correspondants càd les glycoprotéines membranaires.

40 mn après l'addition des anticorps marqués, on observe au microscope à U-V, une fluorescence

homogène (verte et rouge) sur toute la surface de l'hétérocaryon.

Donc le complexe antigène-anticorps de type souris et de type humain se sont mélangés dans la

membrane de l'hétérocaryon. On peut conclure que les protéines membranaires se déplacent ou

diffusent dans la membrane plasmique.

5.3. Marquage par des isotopes radioactifs

Le principe de cette technique repose sur l'insertion dans une molécule donnée un isotope radioactif à la

place d'un atome stable naturellement présent dans cette molécule. La molécule ainsi marquée est suivie

beaucoup plus facilement dans l'organisme ou dans un tissu.

En général, le protocole est basé sur le modèle Pulse-chase qui comprend deux étapes :

 Pulse : c’est l’exposition des cellules vivantes, pendant une période brève, à un précurseur

fortement radioactif assimilable.

 Chase : les cellules subissent de nombreux lavages afin d’éliminer les précurseurs radioactifs non

assimilés. Elles sont ensuite incubées sans radioactivité. L’expérience consiste ensuite à suivre le

cheminement de la radioactivité dans la cellule.

L’intérêt de cette technique est double: elle peut permettre de suivre les transformations de la molécule

marquée en d’autres molécules dans les voies métaboliques. Elle peut permettre aussi de suivre la

radioactivité à travers les différents compartiments cellulaires.

34

La radioactivité