Contrôle microbiologique des aliments – Manuel technique

traitements antimicrobiens de conservation, demballage ou de nettoyage etc. Les microorganismes

susceptibles d tre rencontr s appartiennent pour la plupart aux groupes 1, 2 et ventuellement 3.

Ceci impose donc des r gles fondamentales de conception et de fonctionnement du laboratoire

danalyse microbiologique.

Le laboratoire doit tre compos de trois parties principales :

• le laboratoire proprement dit o sont r alis es les analyses
• la salle de pr paration des milieux de culture
• la laverie qui traite les produits et mat riels utilis s pour lanalyse et qui fournit la verrerie et le

mat riel propre et st rile. La laverie et la salle de pr paration peuvent ne constituer quune seule

pi ce.

Echantillonnage

pr l vement

Mat riel

usage unique

Ensemencement

Etuvage

Echantillons

analyser

LABORATOIRE

Salle de manipulations

Lecture

Stockage des milieux

et mat riels st riles

st rilisation

• autoclave
• filtration

pr paration des

milieux

mat riels contamin s

Verrerie sale

non contamin e

Autoclavage

(121 C , 20 mn)

Lavage

D chet

poubelle

Cotonnage

St rilisation

four Pasteur

(180 c, 10 60 mn)

Le laboratoire danalyse doit disposer :

• dun espace suffisant avec une circulation limit e. Deux ou trois parties sont souhaitables mais

non n cessaires.

• de murs, plafonds et sol lisses mais non glissants, non absorbants, faciles nettoyer et

d sinfecter.

• dun clairage naturel ou artificiel de bonne qualit . Les fen tres coulissantes avec montants

aluminium quip es de volets roulants conviennent bien.

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• de plans de travail lisses et r sistants.

• de lampes UV dispos es au plafond et quip es dune minuterie au moins dans la salle de travail.

Le plan pr sent sur la figure 1 est une proposition type de conception du laboratoire. Il ne faut pas

perdre de vue que le bon fonctionnement du laboratoire requiert, en particulier aux niveaux des

manipulations, des personnels qualifi s. Propret et r gles dhygi ne strictes doivent y r gner.

documentation

bibliographie

bain-marie

viers

four Pasteur

rangements

produits divers

viers

paillasses

tag res

bureaux

lave-vaisselle

pr paration de milieux

autoclave

tuves 25 -30 (37)-44 C

hottes flux laminaires

figure 1 . Sch ma type dun laboratoire danalyse microbiologique

frigo

souchier

D.

MATERIEL

MICROBIOLOGIQUE

DEQUIPEMENT

DU

LABORATOIRE

DANALYSE

L quipement dun laboratoire de microbiologie alimentaire diff re peu de celui dun laboratoire de

bact riologie m dicale. Il faut disposer ainsi dune r serve de produits chimiques les plus courants

et de milieux ou de composants de milieux de culture (deshydrat s si possible) et de colorants. En

microbiologie alimentaire, la fr quence des tudes quantitatives et qualitatives et leur vari t font

quil est n cessaire de disposer dun nombre lev de milieux de culture et de mat riels divers

(tubes essai, erlenmeyers, bo tes de P tri, pipettes, etc).

Il est indispensable de disposer dun certain nombre d quipements et de mat riels tels que :

D . 1 . Syst mes de st rilisation / d sinfection et zones st riles:

1) Lautoclave vertical ou horizontal pour la st rilisation en milieu vapeur des milieux, des

d chets est indispensable. La st rilisation est g n ralement r alis e 115 ou 120 C pendant

10 30 minutes.

2) Le four Pasteur permet la st rilisation sec du mat riel en verre ou en m tal et doit pouvoir

atteindre une temp rature de 170 - 180 C.

3) Les syst me de micro ou ultra filtration membrane sont utilis s pour les milieux de culture

liquides non autoclavables et pour lanalyse e liquides (eau par exemple).

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4) Les lampes UV germicides munies dune minuterie et install es dans la pi ce principale de

manipulation ainsi que dans les hottes flux laminaires. Leur effet sur un germe donn est fonction

de la puissance de la lampe, de la longueur donde du rayonnement UV, de la distance et du temps

dirradiation. Elles sont efficaces sur les zones clair es . Il est essentiel de se prot ger vis- -vis

dune exposition directe, la muqueuse oculaire tant particuli rement sensible.

5) Les r cipients contenant par exemple de lhypochlorite de sodium pour recueillir les

mat riels souill s tels que lames tats frais, les pipettes, les c nes usage unique etc. La

r cup ration des milieux contamin s apr s lecture peut se faire dans des sacs en polypropyl ne qui

ne seront limin s quapr s autoclavage.

6) Les zones de travail sont situ es dans la zone de protection de becs Bunsen avec d clenchement

par bouton pied et/ou dans des hottes flux laminaires qui selon leur fonctionnement

prot gent avec efficacit soit le produit (figure 2), soit lop rateur (figure 3), soit les deux (figure

4), ces hottes tant class es en trois cat gories en fonction de leur fonctionnement. Elles sont

utilis es pour la distribution aseptique des milieux et le remplissage de bo tes de P tri. Un flux dair

st rilis par filtration est dirig sur la zone de travail soit horizontalement, soit verticalement avec

ou non un recyclage. Il ne sagit pas de zones de s curit et les hottes de classe I ne peuvent pas tre

employ es seules pour les manipulations des microorganismes ; dans ce cas, le travail st rile est

r alis dans la zone de protection dun bec de gaz, ce dernier pr sentant n anmoins linconv nient

de perturber le flux dair dans le syst me.

lampe UV

lumi re

e

n

i

b

r

u

t

HOTTES DE CLASSE I

Protection du produit

filtre polyamide d'efficacit de

r tention de 90 % pour des

particules de d> 5 m

filtre absolu d'efficacit de

r tention de 99,999 % pour

des particules de d > 0,3 m

figure 2 . Hottes flux laminaire horizontal de classe I avec protection du produit

HOTTES A FLUX

LAMINAIRE

horizontal de classe I

Protrection du

manipulateur

pas du produit

figure 3 . Hottes flux laminaire horizontal de classe I avec protection du manipulateur

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HOTTE DE CLASSE II

flux vertical

Protection du produit et

du manipulateur

figure 4 . Hotte flux laminaire vertical de classe II avec protection du manipulateur et du produit

Les hottes de classe III prot gent avec une tr s grande efficacit produit et manipulateur mais restent

dune utilisation difficile. Il sagit en fait de bo tes gants tanches et st riles (figure 5).

HOTTE DE CLASSE III

igure 5. Hotte flux laminaire de classe III

Dans ces hottes la vitesse lin aire de lair est voisine de 0,25 1 m.sec-1. La d contamination de ces

hottes doit tre effectu e quotidiennement (surface de travail et c t s). Le formol est certainement

le meilleur d sinfectant car il assure la st rilisation la plus homog ne; les ph nols laissent des

r sidus, et lhypochlorite est tr s corrosif. L tanch it de la hotte doit tre contr l e ainsi que

lint gralit du filtre st rilisant HEPA. Si ce dernier filtre doit tre chang , il faut le faire

aseptiquement et placer imm diatement le filtre dans un emballage en polypropyl ne tanche.

Fabrication du formol

Le formol peut tre g n r par bullition dune solution de formald hyde 40 %. Sa concentration

d sinfectante optimale est de 50 mg.m-3 qui sont par exemple obtenus par bullition de 25 ml de

formol 40 % dans une hotte de 0,35 m3.Le formol peut aussi tre g n r partir du chauffage

sec de paraformald hyde (3 g par hotte) ou par addition de 6 g de permangante de potassium 25

ml de formol 40 % temp rature ambiante. Il est galement possible de g n rer la quantit de

formol n cessaire la st rilisation de la hotte par m lange de 4 g de paraformald hyde, 8 g de

permanganate de potassium et 10 ml deau. La dur e de ce type de traitement doit tre dune dizaine

dheures et le syst me de ventilation mis en marche au moins une demi-heure avant r utilisation.

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D . 2 . Mat riels dincubation et de pr paration des milieux

Il faut disposer d tuves bact riologiques qui doivent pouvoir tre r gl es avec pr cision entre 25 et

55 C. Trois temp ratures d tuvage sont g n ralement utilis es en microbiologie alimentaire.

Deux jarres ana robies et leur n cessaire de contr le de latmosph re (catalyseur, g n rateur

dhydrog ne et de gaz carbonique, indicateur au bleu de m thyl ne) sont indispensables l tude

des germes ana robies stricts.

Deux bains-marie sont n cessaires pour r g n rer les milieux de culture (100 C) et les maintenir en

surfusion (45 47 C). Une diminution de l mission de vapeur deau est obtenue par recouvrement

de la surface par des petits morceaux de polystyr ne.

Un four microondes permet de r duire la dur e des traitements thermiques des milieux

(pr paration chaud, r g n ration).

Deux balances (port e 1 2 kg au 1/10 de g et port e denviron 200 g au 1/10 de mg) sont

indispensables la pr paration des milieux et de l chantillon.

Il faut toujours disposer de nombreux tubes essai en verre de 16 x 160 ou 18 x 180 mm

(r utilisables apr s lavage et bouch s au coton card ou avec des bouchons thermostables en

polypropyl ne) ou des tubes en polycarbonate st riles et usage unique (tubes h molyse) et de

r cipients de volumes vari s et st rilisables (flacons, erlenmeyers, b chers etc).

Des pipettes st riles usage unique, et des syst mes de pipetage automatiques c nes

st rilisables en propyl ne et usage unique sont

Un agitateur magn tique chauffant (barreaux t flon s) et une seringue de Cornwall ou un

r partiteur volum trique sont n cessaires la pr paration est la distribution des milieux.

D . 3 . Pr paration des chantillons et culture microbienne

Les chantillons sont amen s au laboratoire dans leur emballage dorigine sil sagit de produits

finis ou dans des flacons ou r cipients st riles sil sagit de produits en vrac ou de pr l vements.

Il faut parfois disposer de mat riels permettant le pr l vement daliments dans des emballages

solides (poin ons, ouvre-bo tes) ou encore de mat riels indispensables au pr l vement daliments

solides ( caut risateurs, pipettes harpons, etc).

Le premier traitement auquel sont soumis la plupart des produits consiste, apr s pr l vement dune

partie aliquote, en une homog n isation . Celle-ci est r alis e au moyen de mortiers ou par des

broyeurs couteaux (Virtis par exemple) ou des appareils de Potter ou encore par un Stomacher

(figure 6).

Cette op ration doit permettre la mise en suspension homog ne des microorganismes pr sents sur

ou dans le produit analys en vitant cependant toute contamination externe ou une inactivation des

germes par des conditions trop drastiques (ultra turrax avec chauffement par exemple).

Une centrifugeuse atteignant 3 4000 g permet, en peu de temps, de d canter les microorganismes

pr sents dans les liquides. Des tubes bouch s sont indispensables pour viter la contamination

a rienne.

Un vortex permet dhomog n iser les suspensions bact riennes pr sentes dans les tubes, en

particulier au moment des dilutions ou des pr l vements. Avec cet appareillage, il faut engendrer un

nSud de vibration entre pouce et index une hauteur du tube qui est en dessous du niveau du coton

card .

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mortier et pilon

Broyeur de POTTER

broyeur type

VIRTIS

homog n isateur type

Stomacher

figure 6 . Sch ma des divers syst mes de broyage / homog n isation

Un tr s grand nombre mat riels usage unique (si possible) comme des bo tes de P tri en

polycarbonate de 90 mm de diam tre ou plus, de tubes essai et h molyse, des pipettes gradu es

st riles (1 et 10 ml) ou de pipettes automatiques (de 0,1 ou 1 ml) c nes en polypropyl ne

st rilisables, des pipettes Pasteur, des cannes de verre, des anses de platine etc.

Un ensemenseur spiral et un compteur de colonies laser ou par analyse dimage ne simposent que

si le nombre danalyses r aliser quotidiennement est lev . Pour faciliter la num ration des

colonies dans les bo tes de P tri il est possible dutiliser un syst me du type stylo-compteur. Un

syst me complet de filtration doit faire partie int grante de l quipement de base du laboratoire.

D . 4 . Microscopie

Bien que non prioritaire parmi les quipements, le microscope et son environnement de lames,

lamelles, colorants et r actifs divers, constitue un outil important du laboratoire danalyse

microbiologique. Pour un agr ment dutilisation avec un minimum de fatigue et une meilleure

image il est souhaitable dadopter les syst mes binoculaires. De nombreux fabricants proposent un

choix important de tels quipements; il faut veiller la qualit des optiques, mais aussi de la partie

m canique de lappareil. Les oculaires x10 sont les plus communs et il faut disposer dobjectifs

x10, x 40 sec et x100 immersion. Lentretien des parties optiques du microscope doit tre r alis

avec soin (xyl ne et papier joseph); il est aussi n cessaire de v rifier p riodiquement le centrage de

la lampe avant le condenseur.

Pour lanalyse en DEFT, il faut disposer dun microscope adapt ( pifluorescence). L volution des

techniques immuno-microbiologiques avec d tection de marquage par anticorps fluorescents

requiert galement des appareils adapt s. Les microscopes quip s de platines motoris s et dune

cam ro vid o permettant la saisie et le traitement des images (au moyen de logiciels de plus en plus

perfectionn s et accessibles);

la mesure ou

lautomatisation et le traitement de limage seront simples et performants.

Les r actifs colorants les plus utilis s sont ceux qui permettent la coloration de Gram ( thanol,

violet de gentiane, lugol, fuchsine) ou des colorations simples (bleu de m thyl ne ph niqu ). Ces

r actifs sont disponibles pr ts lutilisation chez bon nombre de fournisseurs de produits. Veiller

ils constitueront un outil performant dans

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ne pas colorer la peau (doigts en particulier), certains de ces colorants r agissant avec les

prot ines ou les acides nucl iques.

La pr sence dune loupe binoculaire (x 100 par exemple) permet, entre autre, de bien caract riser

les colonies.

E . TECHNIQUES GENERALES

Leau les mati res premi res et bon nombre de denr es alimentaires ne sont pas, quelques

exceptions pr s comme le lait st rilis , les conserves par exemple, des produits st riles. La qualit

marchande des produits d pend beaucoup du contr le de la flore pr sente par des moyens

physiques (temp rature, pH, activit de leau par exemple) ou chimiques (additifs effets

antimicrobiens) et par des r gles de bonne fabrication. Le microbiological guideline comporte

en effet des r gles appliquer avant, pendant et en fin de pr paration, pour la distribution et le

stokage; ces recommandations sont fond es sur le respect de bonnes pratiques professionnelles

(BPP). Les diverses tapes de ces BPP se situent au niveau des ateliers (construction, mat riels et

machines, outillages, facilit de nettoyage etc.), de la qualit microbiologique des mati res

premi res et de leau , du personnel au niveau de son comportement et de son ducation

hygi niques, de la pertinence et de lefficacit des traitements antimicrobiens appliqu s aux

produits ou aux syst mes potentiellement dangereux et enfin de la mise en place dun ensemble de

conditions de distribution les plus favorables au maintien de la qualit .

Les sp cifications microbiologiques sont des crit res applicables pendant et apr s la pr paration

afin de sassurer que lhygi ne et les conditions de production sont satisfaisantes et en accord avec

la r glementation. Les parties prenantes dun march y trouveront des garanties.

Les normes sont des sp cifications microbiologiques adopt es par la l gislation qui sadressent au

produit fini et fixent les limites acceptables de pr sence de microorganismes donn s dans des

produits bien d finis.

Il existe actuellement de nombreux organismes nationaux ou internationaux (OMS, FAO, ISO,

ICMSF, CEE, AFNOR, CNERNA , DGCCRF, services v t rinaires, etc.) qui se pr occupent de

l tablissement de crit res de qualit microbiologique de nos aliments.

La qualit hygi nique d pend surtout de la nature mais aussi souvent du nombre de la flore

microbienne pr sente dans le produit. Si cette flore est compos e de microorganismes susceptibles

dengendrer des maladies apr s consommation (maladies infectieuses, toxi-infections, intoxinations

) le produit est dangereux et ne doit en aucun cas tre commercialis . Il appartient alors au

microbiologiste de d tecter le ou les points critiques affectant cette qualit hygi nique pour laquelle

la norme z ro d faut doit tre un objectif prioritaire de lensemble du syst me de production.

En bact riologie alimentaire il nest donc pas n cessaire de rechercher, de compter et didentifier

syst matiquement toutes les bact ries, levures et moisissures pr sentes dans le produit. Il suffit

souvent deffectuer :

1) une tude quantitative de la flore microbienne :

• soit par d nombrement dune flore microbienne donn e caract ris e par un ensemble de

propri t s physiologiques communes comme par exemple num ration de la flore a robie

m sophile revivifiable sur un milieu du type g lose nutritive ordinaire (germes h t rotrophes peu

exigeants, m sophiles si la temp rature dincubation est voisine de 30 C avec une dur e

dincubation g n ralement inf rieure 72 heures, neutrophiles si le pH est voisine de 7, a robie ou

a ro-ana robie si lincubation est r alis e lair), la num ration des levures et moisissures

confondues (germes acidophiles, a robies pour la plupart, m sophiles bas etc.), la num ration des

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ana robies sulfito-r ducteurs (germes h t rotrophes, r duisant les sulfites en sulfure dhydrog ne,

m sophiles, ana robies stricts).

La pr sence de bact ries dorigine f cale ou tellurique t moigne dans nos aliments dun

manque dhygi ne et dun d faut de rigueur technique et peut laisser craindre la pr sence

concomittante dans le produit de bact ries ent ropathog nes en nombre difficilement d tectable ou

apr s un temps danalyse important.

• soit par d nombrement dun groupe bact rien pouvant correspondre une contamination

d termin e: coliformes thermotol rants et/ou streptocoques du groupe D pour la mise en vidence

dune contamination dorigine., staphylocoques pour la mise en vidence dune contamination

dorigine cutan e, germes indolog nes, germes putrides , etc...

2) une recherche orient e de certaines bact ries pathog nes telles que Salmonella, Staphylococcus,

Shigella, Mycobacterium, Listeria, Brucella, Campylobacter, Yersinia , etc.... Cette recherche exige

lutilisation de m thodes sp cifiques hautement s lectives.

Le plus souvent, ces analyses ne diff rent dun produit alimentaire un autre que par certains d tails

dex cution. Parmi les analyses communes tous (ou presque tous) les produits alimentaires on

peut citer par exemple les num rations des coliformes ou de la flore totale.

La bonne qualit microbiologique (hygi nique et marchande) est donc fonction de tr s nombreux

facteurs ; le microbiologiste se doit n anmoins de d finir le plus rapidement possible la notion

quantitative et qualitative de flore normale de son produit ou de ses mati res premi res

(microorganismes habituelset tol rables), et dune flore contaminante dont le seuil de tol rance

sera d fini en fonction du risque que fait courir cette flore un type donn de consommateur.

E . 1 . Pr l vements

Les modalit s des pr l vements ont fait lobjet dun arr t publi au J.O. du 19 janvier 1980. Tr s

sch matiquement, la taille de l chantillon dun produit de m me nature r parti en portions unitaires

doit tre au moins de 5 unit s (lieu de fabrication ou de distribution), de 5 unit s pour les conserves.

Le laboratoire doir disposer denviron 500 g de produits, soit 5 fois 100 g, ces 100 g pouvant tre

fournis par une ou plusieurs pi ces. Si le pr l vement de 5 chantillons sav re trop lev par

rapport la production il est proc d un talement dans le temps des pr l vements. Ces

pr l vements doivent avant tout respecter des r gles daseptie et de repr sentativit .

La prise dessai destin e la pr paration de la suspension m re et de ses dilutions doit correspondre

aux parties superficielles et profondes notamment pour les produits en tranche, hach s, divis s et les

plats cuisin s par exemple. Pour les produits liquides elle est effectu e sur le produit homog n is

ou sur les parties superficielles et profondes.

Dans le cas dexamens microbiologiques faisant suite une maladie de type TIA il faut rechercher

les germes dangereux (pathog nes, toxinog nes) et leurs toxines aussi bien dans les pr l vements de

surface que dans la masse.

Il faut tenir compte, pour un produit donn , des disparit s possibles de fabrication et des disparit s

qui existent au niveau des r sultats fournis par le laboratoire (il est g n ralement admis que la

variabilit atteint une puissance de 10 ou m me plus ce niveau) .

E - 1 - a . Echantillonnage

Il sagit l dune tape fondamentale souvent d licate. Les ouvrages consacr s l chantillonnage

sont nombreux et des r gles pr cises par produit ou milieu ont t dict s par lAFNOR et la

DGCCRF; si les chantillons ne sont pas correctement pr lev s et manipul s ou ne sont pas

repr sentatifs dun lot ou dune production, les r sultats danalyse nauront aucune signification.

Contr le microbiologique des aliments Manuel technique. Polytech D partement STIA. Page 12

Un chantillonnage repr sentatif est essentiel quand lanalyse a pour but de d tecter la pr sence de

germes pathog nes ou de toxines qui peuvent tre distribu s de fa on h t rog nes dans laliment ou

quand la commercialisation dun produit d pend de la qualit microbiologique en relation avec les

normes impos es par la l gislation.

1) M thode d chantillonnage pr conis e par lICMSF (Internation Commission on

Microbiological Specifications for Foods)

La Commission Internationale des Normes Microbiologiques relatives aux denr es

alimentaires a d fini des m thodes d chantillonnage pour lanalyse syst matique des produits

alimentaires. Le principe de base est le suivant : un chantillon analys donne des r sultats non

satisfaisants sil renferme des microorganismes dangereux ou sil contient des germes en nombre

sup rieur une limite au-del de laquelle il devient potentiellement dangereux.

Dans cette m thode le symbole m repr sente la limite permettant de r partir les chantillons

en 2 groupes: les acceptables (valeur (cid:1) m) et les inacceptables (valeur (cid:2) m). Pour certains

microorganismes dangereux m peut tre gal 0.

Quand un microorganisme donn est tol r dans un aliment 3 cat gories d chantillons sont d finies

:

• cat gorie 1 (acceptables sans r serve)
• cat gorie 2 (acceptables mais avec une limite)
• cat gorie 3 (inacceptables).

m s pare la 1 re et la 2 me cat gories et M la 2 me et la 3 me (figure 7).

m

M

1

3

4

s

n

o

l

l

i

t

n

a

h

c

s

e

d

n

o

i

t

i

t

r

a

p

r

2

acceptables

(satisfaisants)

acceptables

(selon le nombre)

inacceptables

(non satisfaisants)

figure 7. Distribution des chantillons dapr s lICMSF

Il existe deux types de plan d chantillonnage qui sont applicables des syst mes aliments - germes

• consommateurs bien identifi s.

• Plan d chantillonnage 2 classes

Ce plan donne des r sultats permettant de d terminer 2 classes de contaminations. Ce type de plan

naccepte aucune tol rance et correspond le plus souvent aux conclusions : absence dans (le

r sultat est bon et le produit jug satisfaisant) ou encore pr sence dans (le r sultat est mauvais et le

produit est d clar impropre la consommation).

Avec un plan d chantillonnage 2 classes (cat gories 1, 3), n repr sente le nombre d chantillons

examin s. Il existe deux possibilit s pour ce type de plan :

• utiliser la notion de pr sence ou absence

Contr le microbiologique des aliments Manuel technique. Polytech D partement STIA. Page 13

• d terminer la tol rance ou non des num rations sup rieures la valeur critique m

Le symbole c repr sente le nombre d chantillons tol r s au-del de la valeur seuil, nombre qui

permet de juger le lot comme satisfaisant.

Exemple : Pour les viandes de volailles contamin es en surface par Salmonella

m = 0

n = 5 c = 1

Pour la plupart des autres produits on a avec cette bact rie et dautres microorganismes tr s

dangereux (Listeria, Brucella , etc ) m = 0, n = 5 et c = 0.

Pour les viandes de boucherie conditionn es sous vide ou non, r frig r es ou congel es

on a pour la Flore A robie M sophile

m = 5.104

n = 5 c = 0

La rigueur du plan d pend des valeurs de n et de c. Plus grand est n pour une valeur donn e de c,

meilleure sera la qualit des lots accept s. A linverse, si pour une valeur donn e de n, c augmente,

la rigueur du plan diminue.

• Plan d chantillonnage 3 classes

Ce plan est bas sur la reconnaissance de 3 cat gories d chantillons en fonction de leur niveau et

nature de contamination : celle inf rieure ou gale m, celle comprise entre m et le seuil M, celle

sup rieure M. La valeur...